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头颈鳞癌中铁转运蛋白编码基因SLC40A1的表达及影响

2020-07-11 478 上传者：管理员

摘要：目的：探讨SLC40A1在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中的转录和表达水平，及其与患者临床病理特征之间的关联。方法：基于公开数据库GEO和TCGA中HNSCC的数据，分析SLC40A1在肿瘤组织和正常组织中的转录水平差异。利用OncoLnc在线数据库研究SLC40A1转录水平与患者总生存率之间的关系。利用免疫组织化学技术验证HNSCC中铁转运蛋白的表达下调。综合分析SLC40A1的转录和表达水平与患者临床参数之间的关系。结果：基于GEO的两个数据集和TCGA数据库分析，均提示SLC40A1基因在HNSCC中转录下调(P<0.05)，其转录水平和患者临床分期相关。生存分析显示，SLC40A1表达低的患者生存时间较短（HR=0.4954,95%CI:0.28～0.89,P=0.0185）。组织芯片免疫组化结果提示，SLC40A1在HNSCC组织中表达下调(P<0.05)。结论：SLC40A1在HNSCC中普遍表达下调，且与其不良预后有关；SLC40A1基因的转录和表达失活可能影响肿瘤的发生和演进。

关键词：
SLC40A1
分子标志物
头颈肿瘤
头颈部鳞状细胞癌
生物信息学
表达
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头颈部肿瘤是世界上常见的肿瘤之一，其中90%是头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）。目前发现，吸烟、饮酒和人乳头状瘤病毒感染是其重要的致病因素[1]。尽管目前诊疗手段不断提高，但大多数局部进展的HNSCC患者易出现复发或远处转移，5年总生存率低于60%[2]。因此，寻找更多有效的分子标记物和治疗靶点，对于HNSCC的早期诊断和治疗意义重大。

近年来，铁代谢异常已在多种肿瘤中报道。肿瘤细胞通过增加铁摄入和抑制细胞内铁输出，使细胞内铁滞留，进而参与肿瘤的发生与演进[3]。铁代谢异常也在HNSCC中存在，如血清铁蛋白在HN-SCC患者中表达增高，且高血清铁蛋白与HNSCC的远处转移相关[4]。SLC40A1编码的铁转运蛋白（ferroportin）在多种肿瘤中转录和表达下调，其下调与肿瘤的不良预后显著相关[5,6]。而SLC40A1在HNSCC中是否存在转录和表达异常及其肿瘤生物学和转化医学意义如何，尚未明确。因此，本研究通过生物信息学分析工具，整合分析多个公开数据库，结合免疫组织化学技术验证，探究基因SLC40A1在HNSCC的转录和表达水平，分析其与患者的临床病理特征之间的关系。

1、材料与方法

1.1基因表达数据库（GEO）

从基因表达数据库GEO下载包含正常样本的HNSCC芯片GSE29330和GSE33205的数据，分析SLC40A1的转录水平。芯片GSE29330中包含HNSCC患者13例，正常5例；芯片GSE33205中包含HNSCC患者44例，正常25例。

1.2癌症基因组图谱（TC-GA）

利用UCSCXena工具（https://xena.ucsc.edu/）下载TCGA数据库中HNSCC患者测序数据（HN-SC）及配套临床信息，其中包括HNSCC患者522例，正常44例。笔者利用TCGA数据库的数据分析SLC40A1的转录水平与临床相关参数之间的关系。

1.3OncoLnc数据库

OncoLnc网站收集了TCGA中21种肿瘤，共8647例患者的生存数据以及对应的mRNA的转录谱数据。利用网站OncoLnc分析SLC40A1mRNA表达水平的高、低与HNSCC患者总体生存期的关系。

1.4免疫组织化学染色

HNSCC组织芯片购自Biomax公司，芯片（NO.HN803f）包括HNSCC组织69例，正常11例。其中HNSCC组织病理类型包含鳞癌60例，转移癌8例，肉瘤样癌1例。其中HN-SCC组织的具体位置来源如下：牙龈1例、唇2例、面3例、舌4例、鼻5例、头颈部淋巴结8例、口腔15例以及喉31例。该芯片正常组为正常舌组织。芯片中HNSCC患者中男60例，女9例，年龄32～90岁，平均(58.00±11.45)岁；正常11例，年龄15～48岁，平均(28.82±10.31)岁。

铁转运蛋白抗体购自Sigma公司（HPA065634），免疫组织化学染色使用SP9000免疫组化通用试剂盒，具体操作如下：切片脱蜡水化，浸入pH=6.0柠檬酸盐修复液抗原修复液中修复。滴加山羊血清封闭10min，滴加一抗（铁转运蛋白抗体，浓度1∶100），切片4℃冰箱孵育过夜。次日取出切片，使其缓慢恢复至室温。按照免疫组化通用试剂盒说明，加入生物素标记的二抗室温孵育30min，加入辣根酶标记的链霉卵白素，室温孵育30min。DAB显色，苏木精复染，脱水，中性树胶封片保存。

1.5免疫组织化学染色结果判读

由经验丰富的病理学医师对免疫组化染色结果判读，通过染色强度和染色细胞所占比例的乘积来判定。染色强度的评分标准如下：不着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；阳性细胞的百分比评分标准如下：0分为阳性细胞占比0%～5%,1分为占比≤10%,2分为占比11%～50%,3分为占比51%～75%,4分为占比>75%。染色强度计分与阳性细胞百分比计分的乘积记为免疫组化染色综合得分，反映该蛋白的表达水平。

1.6统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用两独立样本t检验；生存分析利用OncoLnc网站基于Kaplan-Meier法分析；受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析，取曲线下面积（AUC)>0.6为存在诊断价值，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1SLC40A1在HNSCC中转录水平下调

在两组GEOHNSCC芯片和TCGA数据库中，SLC40A1在HNSCC的中转录水平低于相应正常组织（均P<0.05），见图1A～图1C。

2.2SLC40A1的转录失活可作为HNSCC的诊断标志物

SLC40A1在HNSCC中较相应正常组织普遍转录下调（P<0.05）。进一步分析TCGA数据库中522例HNSCC患者SLC40A1的转录水平数据，确定最优cutoff值并根据其绘制ROC曲线，结果显示将SLC40A1的转录下调作为HNSCC的诊断指标，其AUC可达0.694(P<0.05），见图1D。进一步分析TCGA数据库中522例患者SLC40A1转录水平与患者临床信息的数据的可能关联，结果表明：SLC40A1的转录水平在肿瘤体积较大（肿瘤T分期）、临床分期较晚（Ⅲ～Ⅳ期）的患者中转录水平较低（P<0.05）。TCGA数据库中SLC40A1转录水平与HNSCC相关临床病理参数的关系（部分HN-SCC患者相关临床信息有缺失），见表1。

2.3SLC40A1低表达与患者的不良预后相关

SLC40A1低表达组的HNSCC患者总生存期较差（HR=0.4954,95%CI:0.28～0.89,P=0.0185），见图1E。

图1SLC40A1在HNSCC基因芯片中的表达情况

表1TCGA数据库中SLC40A1转录水平与HNSCC患者相关临床病理参数的关系

2.4SLC40A1编码的蛋白铁转运蛋白在HNSCC中表达下调

SLC40A1在HNSCC中转录下调，并与肿瘤T分期、临床分期及患者预后相关。进一步通过对组织芯片及免疫组织化学染色技术，在69例HNSCC组织及11例正常组织中SLC40A1编码铁转运蛋白的表达下调。结果显示：铁转运蛋白主要分布于HNSCC细胞质中。对组织芯片免疫组化染色评分显示：正常组样本表达水平为（2.24±2.23),HNSCC组织的表达水平为（0.62±1.11）（图2A），铁转运蛋白在HNSCC中表达下调（P<0.05）（图2B）。

进一步研究组织芯片该组患者肿瘤组织中铁转运蛋白表达水平与相应患者临床参数的关系。统计分析发现，尽管在HNSCC中铁转运蛋白在蛋白水平表达下调，但肿瘤组织中铁转运蛋白的表达水平与患者的性别、年龄、病理分级、临床分期、T分期、N分期以及远处转移情况均无相关性（P>0.05），组织芯片中铁转运蛋白表达量与HNSCC临床病理参数的关系（部分HNSCC组织患者相关临床信息有缺失），见表2。

图2铁转运蛋白在HNSCC组织中的表达情况

表2组织芯片中铁转运蛋白表达量与HNSCC患者临床病理参数的关系

3、讨论

铁是人体生命活动中的重要微量元素，在维持体内细胞的DNA合成和复制、氧的运输、电子传递、能量代谢等过程中发挥重要作用[7]。铁代谢异常是能量代谢的重要分支，铁吸收、运输、储存和调节的过程，涉及包括Wnt信号通路、p53信号通路、缺氧诱导因子、DNA复制、修复和细胞周期相关信号通路在内的多种信号通路，在肿瘤细胞的生物学过程中扮演着重要角色[8,9,10]。SLC40A1编码的铁转运蛋白是目前已知的唯一铁输出蛋白，在肝细胞、十二指肠细胞、巨噬细胞以及胎盘中有较高表达[11,12]。SLC40A1的转录和表达异常必然导致细胞内铁稳态被打破，影响多个信号通路，从而引发细胞生物学功能的变化，其异常表达和突变被报道与癌症有关[13]。本研究发现，SLC40A1基因在HNSCC中呈现普遍转录和表达下调（P<0.05），进一步说明SLC40A1基因的转录和表达下调是肿瘤细胞普遍利用的分子机制，也进一步提示了肿瘤细胞中铁代谢的异常可能在多种人类恶性肿瘤中是普遍的。

近年来多个研究表明，多种肿瘤中存在铁代谢异常的现象。肿瘤细胞一方面可以增加铁的摄入，另一方面也能抑制细胞内铁输出，进而导致滞留细胞内铁增加，引起细胞内铁过剩[3]。而铁过剩则与肿瘤细胞的发生发展、增殖和转移有关[14]。在乳腺癌中，铁转运蛋白表达降低，增加其表达量可以有效抑制乳腺癌肿瘤细胞的生长。在前列腺癌中，铁转运蛋白同样为低表达，增加其表达量可以有效抑制前列腺癌细胞的有丝分裂和迁移能力[15]。同时，研究表明金属镉可以通过抑制乳腺癌中铁转运蛋白的表达，进而影响肿瘤细胞铁稳态，从而达到增强乳腺癌细胞增殖、迁移能力以及上皮组织间变化的进程[5]。在卵巢癌和前列腺癌的研究中都证明了转录因子Nrf2可以对SLC40A1的转录进行抑制，通过过表达SLC40A1能够逆转Nrf2诱导的卵巢癌对顺铂耐药，而SLC40A1的敲低则使顺铂耐药性恢复[16]。由此说明，SLC40A1诱导的铁累积能够导致癌细胞的耐药性增加以及促进肿瘤细胞的增殖和迁移。本研究由此可以推测，SLC40A1在HNSCC的低表达将促进肿瘤细胞的生长和增殖。而在中、晚期头颈癌中，顺铂也是常用的化疗药物，推测SLC40A1可能在HNSCC的耐药中发挥一定的作用。

本文研究表明，SLC40A1的转录水平在肿瘤体积较大及临床分期较晚的患者中转录水平较低（P<0.05）。结合ROC曲线分析，其AUC可达0.694，提示SLC40A1的转录下调在HNSCC中不但是普遍现象，并且可作为HNSCC分期的生物标志物和分子诊断标记物。同时，SLC40A1的转录异常与HN-SCC的预后存在显著相关性，SLC40A1低转录的患者预后较差（P<0.05）。SLC40A1的低转录被认为是多种肿瘤预后不良的独立危险因素，这也在乳腺癌[17]、胰腺癌[6]得到了证实。因此，SLC40A1的转录和表达水平对于HNSCC的预后存在一定的参考价值。本文研究中，铁转运蛋白水平在肿瘤与正常组织中存在差异（P<0.05），而与性别、年龄、分期等其他临床病理参数无关（P>0.05），与SLC40A1的转录水平并不一致，这可能是由于基于SLC40A1转录水平的研究样本量较大，而SLC40A1蛋白表达水平的研究样本量相对较小。另外基因转录水平的衡量基于测序，免疫组织化学染色作为蛋白表达水平的评价方法，精确程度确实存在差异。铁转运蛋白蛋白水平与HNSCC患者临床参数之间的联系仍需进一步研究。

综上所述，SLC40A1在HNSCC中转录和表达水平一致下调，而SLC40A1编码铁转运蛋白是目前已知的唯一铁输出蛋白，揭示铁代谢过程中基因SLC40A1表达异常是HNSCC发生发展的重要因素。同时，SLC40A1转录水平的ROC曲线分析提示SLC40A1可以作为HNSCC诊断的辅助参考指标；而SLC40A1的下调和生存的关系则揭示了SLC40A1在患者预后估计的指导价值。因此，SLC40A1可以为HNSCC的诊断提供参考价值以及为其治疗提供新的思路，是有潜力的新的HNSCC生物靶标。

仝妍,冯国飞,赵蔚林,张哲.铁转运蛋白编码基因SLC40A1在头颈鳞癌中表达及影响[J].广西医科大学学报,2020,37(06):1108-1112.

基金:广西自然科学基金资助项目(No.2018GXNSFBA281158)