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ACTN1在头颈部鳞癌中的表达及其与预后和免疫浸润的关系

2024-08-13 19 上传者：管理员

摘要：目的通过生物信息学方法探讨肌动蛋白a1 （ACTN1）在头颈部鳞癌（HNSCC）中的表达及其与预后和免疫细胞浸润的关系。方法从TCGA数据库中下载头颈部鳞癌的数据集及分析ACTN1 m RNA在HNSCC组织中的表达情况，利用GEPIA数据库分析ACTN1 m RNA表达水平与预后的关系；采用HPA数据库分析HNSCC组织及正常组织中ACTN1蛋白表达水平及定位情况，TIMER数据库分析HNSCC组织中ACTN1表达水平与免疫细胞浸润程度的相关性，UALCAN数据库筛选HNSCC组织中与ACTN1的共表达基因，采用DAVID数据库对共表达基因进行GO和KEGG富集分析。结果与正常组织相比，HNSCC组织中ACTN1 m RNA表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与TP53基因未突变的HNSCC组织相比，TP53基因突变HNSCC组织中ACTN1 m RNA表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。ACTN1高表达和低表达组患者的中位生存时间分别为32.72个月和57.31个月，K-M曲线显示，ACTN1 m RNA高表达组总生存率相对更差（HR=1.500,P=0.002）。免疫组化结果显示，HPA数据库中4例HSNCC组织中ACTN1均为高表达，而1例正常口腔黏膜组织中ACTN1为低表达，ACTN1在HNSCC组织中主要表达于细胞质中，呈现棕黄色颗粒。在HNSCC中，ACTN1 m RNA表达水平与B细胞（r=-0.168,P<0.001）和CD8+T细胞（r=-0.198,P<0.001）浸润程度呈明显负相关，与CD4+T细胞（r=0.217,P<0.001）、巨噬细胞（r=0.099,P=0.030）、中性粒细胞（r=0.218,P<0.001）和树突状细胞（r=0.165,P<0.001）浸润程度呈显著正相关。在HNSCC中，与ACTN1具有显著正相关性和负相关性基因分别有1 501个和258个。GO和KEGG富集分析结果显示，HNSCC组织中与ACTN1共表达的50个基因主要富集于上皮细胞迁移的调控及蛋白质转运、足细胞黏附、细胞-细胞连接等、钙粘着蛋白及肌动蛋白结合、肌动蛋白骨架的调控等。结论 ACTN1在HNSCC组织中显著高表达，可作为HNSCC预后不良的标志物，ACTN1可能通过调节免疫细胞浸润参与HNSCC的发生发展。

关键词：
HNSCC
免疫细胞浸润
头颈部鳞癌
标志物
肌动蛋白a1
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头颈部鳞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)占头颈部肿瘤的90%以上。HNSCC主要起源于咽喉、口腔等黏膜的鳞状上皮[1]，烟酒、HPV感染、TP53基因突变等均是HNSCC发病的危险因素[2-3]。此外，多种炎症因子[4]及信号通路[5]调控异常等均参与了HNSCC发病的机制。早期HNSCC主要采用手术、放疗等，晚期HNSCC则采取化疗为主的综合性治疗，晚期HNSCC预后较差，5年生存期约为45%[6]。因此，早期明确HNSCC的预后标志物对提高患者生存期有着重要意义。肌动蛋白a1 (ACTN1)是一种可编码蛋白的基因，主要参与调控细胞的运动及迁移功能[7]。近年来发现ACTN1在多种恶性肿瘤如胃癌[8]、肝癌[9]等显著高表达，但目前关于ACTN1在HNSCC中的表达水平及相关促癌机制尚不清楚。本研究通过生物信息学方法探讨ACTN1在HNSCC中的表达水平及其与预后和免疫细胞浸润的关系。

1、资料与方法

1.1 数据库来源

TCGA数据库；GEPIA数据库；ULCAN数据库；HPA数据库；TIM-ER数据库；DAVID数据库。

1.2 研究方法

1.2.1 ACTN1在肿瘤组织中的表达

从TCGA数据库中下载HNSCC患者基因表达数据。样本中ACTN1 mRNA表达水平采用Log2转换。ULCAN数据库分析HNSCC组织及正常组织中ACTN1 mRNA表达水平的差异，进一步分析HNSCC组织中ACTN1mRNA表达水平与TP53基因突变的关系。

1.2.2 总体生存率差异

GEPIA数据库分析ACTN1表达水平和HNSCC患者总体生存率(overall survival rate)的关系。

1.2.3 HNSCC组织中ACTN1蛋白表达及定位

利用HPA数据库分析ACTN1蛋白在HNSCC组织及正常口腔黏膜组织中的表达及定位。

1.2.4 HNSCC免疫浸润细胞分析

TIMER数据库分析HNSCC组织中ACTN1表达水平与免疫细胞B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞及中性粒细胞的浸润程度的相关性。

1.2.5 共表达基因及GO和KEGG富集分析

HN-SCC组织中与ACTN1的共表达基因采用ULCAN数据库进行筛选，参数设置为P-Spearman<0.05，分别获取前25个与ACTN1呈显著正相关和显著负相关的基因并绘制热图。对前50个共表达基因的GO和KEGG富集分析采用DAVID数据库进行，GO分析包括细胞组成、分子功能和生物学过程。

1.3 统计学方法

HNSCC组织和正常组织以及HNSCC组织中TP53基因突变及未突变ACTN1mRNA表达差异的比较采用Wilcoxon检验，ACTN1mRNA表达水平与HNSCC患者预后的关系采用K-M曲线分析，ACTN1 mRNA表达水平与免疫细胞浸润程度的相关性采用Spearman相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 ACTN1在HNSCC中的表达水平及其与TP53基因突变的关系

与正常组织相比，HNSCC组织中ACTN1 mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与TP53基因未突变的HNSCC组织相比，TP53基因突变HNSCC组织中ACTN1 mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2 HNSCC患者ACTN1表达水平与生存率的关系

将518例HNSCC患者根据ACTN1 mRNA表达水平分为ACTN1高表达(n=259)和低表达(n=259)两组，ACTN1高表达和低表达组中位生存时间分别为32.72个月和57.31个月。K-M曲线显示，ACTN1mRNA高表达组总生存率相对更差(HR=1.500,P=0.002)，见图2。

2.3 HSNCC组织及正常组织中ACTN1蛋白的表达及定位

免疫组化结果显示，HPA数据库中4例HSNCC组织中ACTN1均为高表达(染色强度>75%)，而1例正常口腔黏膜组织中ACTN1为低表达(染色强度<25%)。抗体为HPA006035。ACTN1在HN-SCC组织中主要表达于细胞质中，呈现棕黄色颗粒，见图3。

图1 ACTN1在HNSCC组织中的表达

图2 HNSCC组织中ACTN1 mRNA表达水平与患者总体生存率的关系

图3 ACTN1蛋白在HNSCC组织和正常口腔黏膜组织中的表达(×100)

2.4 HNSCC中ACTN1 mRNA表达与免疫细胞浸润的相关性

Spearman相关性分析结果显示，在HNSCC中，ACTN1 mRNA表达水平与B细胞(r=-0.168,P<0.001)和CD8+T细胞(r=-0.198,P<0.001)浸润程度呈显著负相关，与CD4+T细胞(r=0.217,P<0.001)、巨噬细胞(r=0.099,P=0.030)、中性粒细胞(r=0.218,P<0.001)和树突状细胞(r=0.165,P<0.001)浸润程度呈显著正相关，见图4。

2.5 HNSCC中ACTN1的共表达基因及GO和KEGG富集分析

在HNSCC中，与ACTN1具有显著正相关性和负相关性基因分别有1 501个和258个。前25个差异表达基因热图见图5。DAVID数据库对前50个差异表达基因进行GO和KEGG富集分析，结果显示，HNSCC组织中与ACTN1共表达的50个基因富集的生物学功能包括上皮细胞迁移的调控及蛋白质转运等，细胞组成包括足细胞黏附、细胞-细胞连接等，分子功能包括钙黏着蛋白及肌动蛋白结合等；富集的KEGG信号通路包括肌动蛋白骨架的调控及紧密连接等，见表1。

图4 HNSCC组织中ACTN1 mRNA表达水平与免疫细胞浸润程度的相关性

图5 HNSCC中前25个与ACTN1共表达基因的热图

表1 HNSCC中与ACTN1共表达基因的GO和KEGG富集分析(前5个条目)

3、讨论

流行病学研究结果显示，2017年全球新发89万例HNSCC患者，约占所有恶性肿瘤的5.3%[10]，与1990年相比新发HNSCC患者数量增加了100%以上，临床上大多数HNSCC患者确诊时已处于晚期，预后较差。因此，寻找影响HNSCC预后的生物学标志物对靶向生物治疗及改善患者的生存状况尤其重要。ACTN1属于肌动蛋白结合蛋白，ACTN1在调节细胞骨架并维持正常的细胞形态及功能具有重要作用，当ACTN1高表达后会诱导细胞骨架异常，从而最终导致肿瘤的发生发展[7]。近年来大量研究证实ACTN1高表达与多种肿瘤的发病机制密切相关[8-9,11-12],Zhang等[8]研究证实，ACTN1在胃癌组织中显著上调，ACTN1可通过活化AKT/GSK3 b/b-catenin通路调控胃癌的上皮-间充质转化和肿瘤细胞的增殖和侵袭；Chen等[9]也发现ACTN1基因沉默后可显著抑制肝癌细胞的增殖和体内小鼠肿瘤的生长，在机制上主要与敲低ACTN1后活化Hippo信号通路有关。Oroxylin A属于黄芩中的一种黄酮类化合物，具有抑制肿瘤作用，在乳腺癌中，研究显示Oroxylin A能显著抑制乳腺癌细胞的增殖主要是通过特异性结合ACTN1并显著抑制其表达，最终阻断癌症相关成纤维细胞的激活有关[11]。在非实体肿瘤如白血病中[12],ACTN1高表达与较短的无事件生存期(EFS)和总生存期(OS)显著相关(P<0.01),ACTN1高表达是急性髓细胞白血病患者独立的不良预后因素。本研究发现，ACTN1 mRNA在HNSCC组织中显著高表达，说明ACTN1可能在一定程度上促进了HN-SCC的进展。TP53基因简称为p53基因，p53属于抑癌基因，主要可编码p53蛋白，p53基因突变在HNSCC的发展发挥了重要作用，抑癌基因p53在HNSCC生长中具有负调控作用[13-14]。一项基于68例晚期HNSCC患者的全基因组测序结果显示，p53基因突变的患者对顺铂化疗具有显著的化疗耐药性，且p53基因突变的HNSCC患者化疗后复发的风险更高[15]。此外，p53基因突变后HNSCC患者更易对放疗出现放疗抵抗现象[16]。本研究同样发现，与非TP53基因突变组相比，TP53基因突变组HNSCC患者ACTN1 mRNA表达水平升高更为显著，这也间接说明ACTN1 mRNA高表达组患者的治疗疗效及预后较差。本研究中ACTN1mRNA高表达组中位生存时间较ACTN1 mRNA低表达组显著缩短，结果提示ACTN1是HNSCC预后不良的一个生物学标志物。

肿瘤微环境在肿瘤的发生、转移、预后中扮演了重要作用，免疫细胞、非免疫细胞及细胞外成分共同组成肿瘤微环境，其中免疫细胞包括B细胞、T细胞、中性粒细胞及巨噬细胞等[17-18]。本研究发现，HNSCC组织中ACTN1 mRNA表达水平与CD8+T淋巴细胞浸润程度呈显著负相关，而CD8+T淋巴细胞对细胞内病原体及肿瘤保护免疫具有重要意义，当组织持续暴露于肿瘤中，CD8+T淋巴细胞过度暴露可引起CD8+T淋巴细胞功能衰竭。Jansen等[19]研究证实，肾癌组织标本中CD8+T细胞占比0.002%～20%，在CD8+T细胞低于2.2%以下的患者术后出现疾病进展的风险显著升高；另一方面，ACTN1 mRNA与中性粒细胞浸润程度呈显著正相关，中性粒细胞作为一种炎性细胞可形成中性粒细胞诱捕网(NETs)。NETs与多种恶性肿瘤的进展及免疫治疗抵抗有关。在HNSCC中，NETs形成与患者的不良预后密切相关[20]。ACTN1共表达基因功能富集分析结果显示，共表达基因主要富集于上皮细胞迁移的调控、肌动蛋白结及细胞紧密连接等。其他研究同样表明，上皮细胞迁移调控、细胞连接等均与恶性肿瘤的进展有关[21]。

综上所述，本研究证实ACTN1在HNSCC中显著高表达，ACTN1高表达与HNSCC患者的不良预后有关，ACTN1可作为HNSCC潜在的生物学标记物，ACTN1可能通过影响免疫细胞浸润参与HNSCC的进展。然而，ACTN1参与HNSCC发展的具体机制仍需进一步研究。

参考文献:

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[17]刘华联.头颈部鳞状细胞癌的肿瘤微环境及免疫治疗研究进展[J].中国肿瘤生物治疗杂志, 2022, 29(7):671-680.

基金资助:安徽省教育厅重点科研项目(编号:2023AH051781); 安徽省自然科学基金青年基金(编号:2308085QH269);

文章来源:王博,袁涛,范瑞,等.ACTN1在头颈部鳞癌中的表达及其与预后和免疫浸润的关系[J].海南医学,2024,35(15):2171-2175.