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MYO5A 35号外显子跳跃对头颈鳞状细胞癌患者的预后相关研究

2024-03-26 28 上传者：管理员

摘要：目的:探讨MYO5A基因在头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)中作为预后分子标志物的潜力。方法:从TCGA数据库下载HNSCC队列的RNA-Seq数据及相应的临床数据，单变量Cox回归分析MYO5A与患者预后之间的关系。从TCGA SpliceSeq数据库下载MYO5A基因的可变剪接类型，根据剪接百分比(percent spliced in, PSI)值识别差异性表达的MYO5A基因的可变剪接，并分析其与HNSCC患者预后的相关性。最后通过RT-PCR和Sanger测序在细胞系及徐州医科大学附属医院临床样本中进一步验证。结果:MYO5A基因在HNSCC队列中显著高表达，但MYO5A基因整体表达水平并不能作为独立的HNSCC预后风险指标。MYO5A 35号外显子跳跃在HNSCC中发生频率增加，且与预后密切相关。MYO5A 35号外显子跳跃在细胞系及临床样本中均得到了验证。结论:MYO5A 35号外显子跳跃而不是MYO5A基因整体表达水平可作为HNSCC预后独立的分子标志物。

关键词：
HNSCC
MYO5A
可变剪接
头颈鳞状细胞癌
放化疗
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头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)是一种上皮起源的常见癌症类型，已在一些高危地区成为头颈部最常见的恶性肿瘤[1]。早期HNSCC患者在根治性手术切除后辅助放化疗能有较好的预后[2]。然而，由于癌症早期无明显症状，患者一旦确诊往往在中晚期，缺乏敏感的筛查指标增加了对该疾病早期诊断的困难[3]。因此，挖掘具有良好诊断潜力的生物标志物对HNSCC患者的临床预后具有重要的意义。

可变剪接(alternative splicing, AS)是通过单个基因产生几种不同的剪接mRNA进行翻译来增加蛋白质组的多样性的复杂过程[4]。人类90%以上的基因经历可变剪接[5]。剪接因子、RNA结合蛋白和其他调节因子之间的复杂相互作用影响剪接位点选择。导致肿瘤发生的异常剪接模式、肿瘤转录过程的变化对癌症生物学至关重要，许多癌症相关基因经历剪接，以产生具有多种甚至拮抗功能的亚型。MYO5A是肌球蛋白家族的成员之一，被认为是在细胞运输和极化中起主要作用的蛋白质[6]。近年来，诸多研究表明肌球蛋白参与包括癌症在内的多种疾病的发生发展[7],这表明其作为预后生物标志物的巨大潜力。

本研究通过TCGA及GEPIA2数据库数据系统分析了MYO5A基因及基因可变剪接与HNSCC患者临床特征的联系，并探讨了MYO5A 35号外显子跳跃作为预后分子标志物的潜在临床意义。

1、材料与方法

1.1 人体样本和细胞系

从徐州医科大学附属医院收集10例HNSCC患者纳入研究。纳入标准：(1)经组织病理学检查确诊；(2)术前未接受任何手术治疗及放、化疗；(3)不同时罹患其他恶性肿瘤。HNSCC细胞系 Cal27、HN6、人类牙周韧带干细胞(PDLSC)和正常牙龈细胞系HGF-1在含有10%胎牛血清 (FBS) 的GIBCO DMEM高糖培养基中37 ℃、5%CO2培养。本研究经徐州医科大学附属医院伦理委员会批准(审批号：XYFY2023-KL321-01),所有患者均签属知情同意书。

1.2 数据采集和处理

从TCGA数据库筛选HNSCC数据集中的MYO5A基因RNA测序数据和相应的临床信息。从TCGA SpliceSeq数据库下载MYO5A基因可变剪接类型。TCGA SpliceSeq数据库包含7种可变剪接类型：可变受体位点(AA)、可变供体位点(AD)、可变启动子(AP)、可变终止子(AT)、内含子保留(RI)、外显子跳跃(ES)、外显子互斥(ME)。

1.3 差异MYO5A基因可变剪接的鉴定

通过分析42个配对的HNSCC样本，使用Student-t检验来比较配对的正常和肿瘤样品之间的PSI值分布。此外，通过使用Benjamini-Hochberg方法获得校正的P值。显示校正P值<0.05的AS事件被认为是癌症相关的AS事件。

1.4 生存分析

使用survival包进行单变量Cox回归分析。采用Kaplan-Meier(K-M)分析和Log rank检验比较亚组间生存率的差异。

1.5 RNA分离和RT-PCR分析

通过RNA pure Tissue & Cell Kit (DNase Ⅰ)提取总RNA,并使用Prime Script RT试剂盒(TaKaRa)合成cDNA。使用KOD DNA聚合酶(TOYOBO)进行RT-PCR。RT-PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳和TAE电泳缓冲液进行分析。使用以下引物序列(5’→3’):MYO5A-RT-R:TCTGGCCCACTTCTAGTTCG;MYO5A-RT-F:GAGATCACCCGGCTGACC。

1.6 统计学分析

本研究所有统计学分析均采用R软件(3.6.1版)进行，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 HNSCC患者临床病理特征和生存率的相关性分析

TCGA数据库中获得同时具有临床信息及AS数据的501例患者的临床信息。结果见表1,纳入的患者队列包括368例(73.5%)男性和133例(26.5%)女性患者，男性患者人数显著高于女性。其中104例(20.7%)患者复发，217例(43.3%)患者死亡。所有患者的中位随访期为21.3个月(0.1～214个月)。发生部位包括牙槽嵴18例(3.6%),舌根23例(4.6%),颊部21例(4.2%),口底60例(12.0%),硬腭7例(1.4%),喉111例(22.1%),唇3例(0.6%),口腔72例(14.4%),舌127例(25.3%)。口咽9例(1.8%),下咽10例(2.0%),扁桃体40例(8.0%),接近半数的患者(221例，44.1%)被诊断为HNSCC时年龄小于60岁。

随后，应用单变量生存检验检测了本研究中患者的临床病理特征和患者生存率之间的关系。表2结果显示，性别和患者总生存期(OS)具有显著的相关性，而年龄与OS无显著相关。此外，病理分级，T分期，N分期和M分期与OS显著相关。同时，病理分级，T分期和N分期与无复发生存期(RFS)显著相关。然而，年龄、性别、M分期与RFS之间均无相关性。M分期由于缺失数据较多，置信区间较大。综合来看，尽管队列中包含部分删失数据，但生存数据的信息量仍然很大，适用于进一步的生存分析。

表1 HNSCC患者的临床病理特征

2.2 MYO5A在HNSCC组织中的表达及生存率关系分析

比较MYO5A基因在GEPIA2 HNSCC队列中癌症及癌旁样本中的mRNA表达水平，MYO5A在HNSCC中表达水平显著高于癌旁样本，其差异具有统计学意义(图1a)。为了检测MYO5A基因表达水平与HNSCC患者总体生存率和无病生存率之间的关系，本研究采用了单因素Cox回归分析。图1b显示，200个月总生存率和无病生存率与MYO5A基因表达水平并没有显著的相关性。因此，MYO5A基因整体的表达水平不能作为HNSCC预后预测指标。

图1 MYO5A在HNSCC中的表达及生存率关系分析

2.3 MYO5A 35号外显子跳跃在 HNSCC中的风险预测分析

基因可变剪接可产生多个转录本，为了探讨MYO5A基因整体表达水平不能作为HNSCC患者预后预测风险因素的原因，本研究对MYO5A基因可变剪接进行了分析。TCGA SpliceSeq 数据库显示，HNSCC中MYO5A基因共发生了9种可变剪接，包括6个外显子跳跃(ES),2个可变启动子(AP),1个外显子互斥(ME)(表3)。其中仅 MYO5A 35号外显子跳跃的PSI在HNSCC中显著降低(图2a),也就是说，HNSCC中有/无35号外显子的MYO5A转录本的比值显著低于正常组织。单因素Cox回归分析表明MYO5A 35号外显子跳跃是HNSCC患者总体生存率的独立影响因子，并且PSI值较低的HNSCC患者总体生存率低于PSI较高组(图2b)。

图3 MYO5A ES35事件的实验验证

图2 MYO5A在HNSCC中的风险预测分析

2.4 MYO5A 35号外显子跳跃PSI值与HNSCC患者临床病理特征的相关性分析

通过分析年龄、性别、局部浸润、淋巴结转移、病理分级与MYO5A 35号外显子跳跃PSI值的关系，我们发现MYO5A 35号外显子跳跃的低PSI值与患者局部浸润、病理分级密切相关，患者局部浸润程度越高，病理分级越高，MYO5A 35号外显子跳跃的PSI值越低，具有统计学意义(P<0.05) ,见表4。

2.5 MYO5A 35号外显子跳跃的细胞系及临床样本验证

人MYO5A基因全长约220 kb, 包含44个外显子；35号外显子发生跳跃后，可产生包含35号外显子的全长亚型MYO5A-L及不包含35号外显子的截短亚型MYO5A-S。为了检测MYO5A剪接变体在HNSCC细胞系中的差异表达，本研究进行了RT-PCR分析，结果显示，与正常口腔细胞系PDLSC和HGF-1相比，MYO5A-S在肿瘤细胞系Cal27和HN6中高表达(图3a)。随后通过一代测序分析进一步证实了MYO5A-L和MYO5A-S转录本的特异性连接序列(图3b)。同时，在徐州医科大学附属医院临床组织样本中得到了相同的结果(图3c)。该结果与TCGA剪接测序数据的分析一致，MYO5A ES35的PSI值在HNSCC组织中降低，这表明包含35号外显子(MYO5A-L)的转录本减少，而不含35号外显子(MYO5A-S)的转录本增加。以上结果提示MYO5A ES35的异常表达是预测HNSCC患者预后的生物标志物。

3、讨论

HNSCC作为头颈部最常见的恶性肿瘤之一，对患者颜面部及日常生活质量改变带来重要影响[8]。先前的研究已在多个不同癌中，发现了数以千计的在正常组织和癌组织中存在差异的可变剪接事件[9,10],检测这些可变剪接事件产生的剪接变体有作为生物标志物的价值。

表2 OS和DFS临床病理特征的单变量分析

表3 MYO5A基因的9种可变剪接

表4 MYO5A 35号外显子跳跃PSI值与HNSCC患者临床特征的相关性分析

MYO5A是一种基于肌动蛋白的运动蛋白，在ENSEMBL数据库中有50多个不同的转录物[11,12]。肌球蛋白的异常表达可以影响细胞的运动和迁移能力，常作为癌症复发的预后因子[13]。例如：MYO5A作为黑素细胞中黑素体转运所必需的[14],其表达在许多高度转移的癌细胞系和转移性肿瘤组织中升高[15]。此外，已证实MYO5A的过表达促进食管鳞状细胞癌的恶性进程[16]。本研究通过分析HNSCC队列的mRNA表达量发现MYO5A在HNSCC组织中过表达，这与之前的研究发现一致[17],提示MYO5A可能是HNSCC的癌基因。此外，MYO5A的差异表达与HNSCC癌症分期及淋巴结转移状态有关，然而本研究结果显示在HNSCC队列中MYO5A表达量与总体生存率和无病生存率无显著相关性，提示MYO5A的预后价值不显著，因此，认为MY05A可能不足以作为评估HNSCC患者预后的稳定指标。

为了进一步探讨可能的原因，对MYO5A基因可变剪接进行了分析。我们在TCGA spliceSeq数据库中发现MYO5A的9种可变剪接模式，此数目根据数据库的来源及数量，可能存在差异。然而有趣的是，本研究发现仅MYO5A 35号外显子跳跃的PSI值在HNSCC中显著降低，这表明MYO5A的多个剪接变体中MYO5A ES35可能是肿瘤特异性的。为了证明这一假设，通过分析了MYO5A的PSI值与HNSCC患者临床病理特征的相关性，发现MYO5A 35号外显子跳跃的PSI值较低的患者预后较差，提示MYO5A ES35可能成为HNSCC患者的预后生物标志物，但仍需要进一步研究证实。

目前，关于MYO5A的不同剪接变体在癌症中的功能及作用机制的研究非常有限，迄今为止尚未记录其在HNSCC预后中的具体影响机制。主要的研究结果认为肿瘤细胞的增殖与转移离不开营养的摄入与吸收[18],若肌球蛋白在营养转运运输作用中被劫持转而增加癌细胞营养，可能会促进癌细胞的继续增殖从而影响癌症预后[19]。Kravtsov等[20]也提出肌球蛋白的突变会破坏细胞极性，而胞吐对细胞极性的建立至关重要。与这些结果一致，本研究推测由于肌球蛋白对细胞运动及调节细胞内转运有重要作用[13],MYO5A的突变导致进一步影响了胞吐功能或内吞作用失调，这也意味着MYO5A剪接变体在肿瘤增殖及转移进展途径中的作用。

随后在细胞系和临床样品中的验证，证实了所进行的生物信息学分析的有效性和可靠性。然而，本研究仍然存在一定的局限性，首先，本研究的结果基于TCGA数据库，依赖于单一数据库的计算机模拟，可以通过增加其它独立数据集及深入的实验确认来进一步验证MYO5A ES35的预后预测能力。其次，本研究临床样本量较小，且均来自于同一机构，这表明需要多中心大规模患者队列中进行额外的研究，扩大样本量的同时提高研究结果的代表性和可靠性。

综上所述，本研究发现不含外显子35的MYO5A在HNSCC中过表达，且PSI值较低的往往对应不良的临床预后，MYO5A ES35存在作为预后生物标志物的价值，未来的工作应致力于其不同剪接变体在HNSCC中的功能研究和分子生物学验证。本研究中相关生物信息学分析及实验验证可能为这些未来的功能及机制研究提供一个有吸引力的起点。

基金资助:江苏省高等教育自然科学研究项目(编号:22KJB32025);徐州市科学技术局重点研发计划(社会发展)-医药卫生面上项目(编号KC22217);

文章来源:卢芳,宁彤彤,王婕等.MYO5A 35号外显子跳跃对头颈鳞状细胞癌患者的预后相关研究[J].口腔医学研究,2024,40(03):236-241.