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胃癌患者血清lncRNA NEAT1的表达及其意义

2024-10-30 41 上传者：管理员

摘要：目的检测胃癌患者外周血清中长链非编码RNA核富集转录本(NEAT)1的相对表达水平，探讨其应用于胃癌辅助诊断的可能性。方法选取2017年11月至2019年12月南通市肿瘤医院收治的胃癌初诊患者101例为胃癌组，胃良性病变患者60例为胃良性病变组，以及同期体检健康者76例为对照组。分别检测各组血清标本中lncRNA NEAT1相对表达水平和癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)水平，分析lncRNA NEAT1与临床病理参数的相关性，并用受试者工作特征(ROC)曲线评价lncRNA NEAT1、CEA、CA19-9单独及联合应用时的诊断效能。结果胃癌组、胃良性病变组及对照组血清中lncRNA NEAT1的相对表达水平分别为2.163(1.357,2.843)、1.176(0.677,1.381)、1.063(0.570,1.308),组间比较差异有统计学意义(H=52.467,P<0.001)。胃癌患者血清lncRNA NEAT1相对表达水平与患者性别(P=0.353)、年龄(P=0.382)无关，而与肿瘤最大径(P=0.031)、TNM分期(P=0.037)及淋巴结转移(P=0.046)有关。胃癌患者血清中lncRNA NEAT1相对表达水平与CEA、CA19-9均无相关性(P>0.05)。ROC曲线结果显示，lncRNA NEAT1诊断胃癌的曲线下面积和灵敏度均高于CEA、CA19-9单独诊断，三者联合诊断时效能最高。结论胃癌患者外周血lncRNA NEAT1相对表达水平升高，且与部分临床病理参数相关，lncRNA NEAT1有望成为胃癌辅助诊断新的标志物。

关键词：
LncRNA
消化系统恶性肿瘤
胃癌
辅助诊断
长链非编码RNA核富集转录本1
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胃癌作为常见的一种消化系统恶性肿瘤，其发病率居恶性肿瘤第4位，病死率居恶性肿瘤第2位[1]。有研究显示，胃癌发病率在东亚最高，其次是中欧和东欧及南美洲[2]。鉴于其发病率越来越高，胃癌已成为全球沉重的负担，因此采取更有针对性的胃癌预防措施显得至关重要。

随着医疗技术地不断进步，应用靶向生物制剂和联合疗法对胃癌治疗具有相当大的益处，但由于该疾病早期症状不明显，大多数初诊患者就诊时已处于疾病中期甚至晚期，治疗效果不佳且预后很差，甚至中位生存期不到12个月[3]。因此，亟须找到一种高效的胃癌早期辅助诊断指标。

长链非编码RNA(lncRNA)是指核苷酸序列长度超过200个的转录本，其蛋白质编码潜力较低[4]。但后续研究证实lncRNA主要通过表观遗传调控、转录/剪切调控等方式参与各种生理、病理过程[5]。也有研究表明，lncRNA参与恶性肿瘤的发生发展机制调节，并有望成为其诊断的关键临床生物标志物[6]。

lncRNA核富集转录本(NEAT)1 是NEAT的关键组成部分，是由位于人类第11号染色体上的基因位点转录而来[7]。据报道它在癌症进展中发挥着广泛的作用，lncRNA NEAT1表达失调是人类癌症的不利影响因素[8]。近年来，许多研究发现它是一种促癌因子，在多种实体瘤的发生发展过程中发挥促进作用，例如，CHENG等[9]发现性别决定区Y框蛋白9可反式激活lncRNA NEAT1,并通过蛋白激酶A/Hippo信号通路促进肝癌干细胞的自我更新；CHEN等[10]发现lncRNA NEAT1通过竞争性海绵化微小RNA-16-5p抑制其表达，促进原发性肝癌(HCC)细胞的生长和转移，抑制HCC细胞凋亡。WEN等[11]研究发现lncRNA NEAT1可通过N6-甲基腺苷促进前列腺癌发生骨转移；MA等[12]认为锌指蛋白转录因子5和lncRNA NEAT1呈正相关。此外，lncRNA NEAT1可通过充当染色质重塑复合物SWI/SNF核心催化亚基的支架来沉默胃癌中的GADD45A基因，从而促进肿瘤发生；WANG等[13]发现lncRNA NEAT1表达增加与喉鳞状细胞癌(LSCC)的颈部淋巴结转移、临床分期、饮酒史或吸烟史相关，参与了LSCC的进展，并且可能作为肿瘤致癌基因发挥作用。本文就lncRNA NEAT1在胃癌患者血清中的表达情况进行研究，以期发现新的胃癌辅助诊断的分子靶标。

1、资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年11月至2019年12月经南通市肿瘤医院确诊的胃癌初诊患者(未经手术、放化疗等抗肿瘤治疗)101例为胃癌组，其中男65例，女36例；年龄44～87岁，平均(66.98±8.86)岁。选取同期胃良性病变患者(包括胃溃疡及胃息肉)60例为胃良性病变组，其中男32例，女28例；年龄30～82岁，平均(60.72±15.56)岁。另选取同期体检健康者(经胃镜检查无异常)76例为对照组，其中男46例，女30例；年龄35～83岁，平均(66.21±10.16)岁。本研究经南通市肿瘤医院伦理委员会审批通过，受试者均知情同意。

1.2 仪器与试剂

lncRNA NEAT1、GAPDH引物购自上海生工生物工程股份有限公司，cobas Z480PCR仪、E601化学发光仪、LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)检测试剂盒均购自德国罗氏公司，逆转录扩增仪购自美国BIO-RAD公司，血清总RNA提取试剂盒购自北京BioTake有限公司，超微量分光光度计及逆转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1

采集各研究对象的空腹静脉血5 mL于真空采集管中,分离血清于RNase-free的EP管内,于-80℃冰箱冻存。严格按照提取试剂盒说明书要求提取总RNA,并用超微量分光光度计检测所提取的总RNA纯度,A260/280均在1.8～2.0,可应用于后续试验。

1.3.2 cDNA逆转录合成体系

5×Reaction Buffer 4 μL,dNTPs 2 μL,OligoDT primer 1 μL,Ribolock Rnase Inhibitor 1 μL,Reverse Transcriptase 1 μL,RNase-free H2O 1 μL,总RNA 10 μL。参照设定反应程序：42 ℃ 60 min, 70 ℃ 5 min, 4 ℃保持。上机逆转录合成cDNA。

1.3.3 实时荧光定量PCR(qPCR)检测

PCR反应体系：SYBR Green Ⅰ Master mix(Rox)10 μL,RNase-free H2O 5 μL,Forward primer 1 μL,Reverse primer 1 μL,cDNA 3 μL。以GAPDH为内参，进行PCR反应，定量方法选用2-ΔΔCt。反应条件：95 ℃ 5 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s; 共45个循环。反应完成立即采集72 ℃荧光信号并绘制熔解曲线，验证反应产物的特异性。lncRNA NEAT1和GAPDH内参各做3个复孔，取平均值。lncRNA NEAT1上游引物为5′-ATGCCACAACGCAGATTGAT-3′,下游引物为5′-CGAGAAACGCACAAGAAGG;GAPDH上游引物为5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′,下游引物为5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′。

1.3.4 CEA、CA19-9水平测定

采用罗氏E601电化学发光仪检测CEA和CA19-9水平，全程质控在控。

1.4 统计学处理

采用SPSS21.0软件进行数据处理和分析，GraphPad Prism8.0软件绘图。呈正态分布的计量资料以

表示，组间比较采用t检验；不呈正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示，分别采用非参数Mann-WhitneyU检验和Kruskal-WallisH检验进行两两比较和多个独立样本的比较；lncRNA NEAT1与CEA、CA19-9的相关性分析使用非参数Spearman检验；采用受试者工作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)评价各检测指标在胃癌临床诊断中的价值，并使用Logistic回归模型分析联合诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 线性范围

取5份胃癌组血清标本混合，将混合血清的cDNA标本进行倍比稀释(1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000),用qPCR的方法分别检测lncRNA NEAT1及GAPDH各稀释样本的Ct值，并绘制其标准曲线。所得lncRNA NEAT1线性方程：Y=-3.508X+23.17,R2=0.995 3,扩增效率公式为E=10-1/slope-1,计算E=0.93说明该方法线性良好。GAPDH线性方程：Y=-3.422X+19.20,R2=0.997 5,E=0.96该方法线性良好，且扩增效率均能满足血清lncRNA NEAT1及GAPDH的测定需求。

2.2 精密度

取5份健康对照血清制成混合血清，提取总RNA并逆转录得到混合cDNA,用qPCR分别检测lncRNA NEAT1与GAPDH的Ct值。该混合cDNA一次性测定20个平行孔，用所得Ct值计算批内变异系数(CV);再将该混合cDNA连续20d重复qPCR检测，所得Ct值计算批间CV。见表1。

表1lncRNA NEAT1与GAPDH Ct值及批内和批间重复性

2.3 血清lncRNA NEAT1的相对表达水平

胃癌组、胃良性病变组和对照组血清lncRNA NEAT1相对表达水平分别为2.163(1.357,2.843)、1.176(0.677,1.381)、1.063(0.570,1.308),组间比较差异有统计学意义(H=52.467,P<0.001),见图1。

2.4 胃癌患者血清lncRNA NEAT1相对表达水平与临床病理参数的关系

结果显示，胃癌患者血清lncRNA NEAT1相对表达水平与患者的性别(P=0.353)、年龄(P=0.382)无关，而与肿瘤最大径(P=0.031)、TNM分期(P=0.037)及淋巴结是否转移(P=0.046)有关。见表2。

图1血清lncRNA NEAT1在胃癌组、胃良性病变组及对照组中的相对表达水平

表2胃癌患者血清lncRNA NEAT1相对表达水平与临床病理参数的关系[M(P25,P75)]

2.5 胃癌患者血清lncRNA NEAT1相对表达水平与CEA、CA19-9的相关性

Spearman相关分析结果显示，lncRNA NEAT1与CEA(P=0.322,R2=0.013)、CA19-9(P=0.943,R2<0.001)均无相关性。

2.6 ROC曲线与诊断效能分析

ROC曲线结果显示，当lncRNA NEAT1的相对表达水平及CEA、CA19-9水平最佳临界值为1.276、3.105ng/mL、41.150U/mL时，其曲线下面积分别为0.837、0.706、0.601,经Logistic回归模型分析，联合诊断的曲线下面积为0.883,见表3。

表3各指标的诊断效能分析

3、讨论

胃癌在全球范围内均具有高发病率和高死亡率的特点[14]。它是一种异质性疾病，由遗传、环境和宿主特征的多重相互作用引起，预后不良且可用的治疗选择有限[15]。胃癌分型包括腺癌、淋巴瘤、胃肠道间质瘤、肉瘤、神经内分泌癌等，腺癌占比超过90%[16]。早期胃癌主要通过手术治疗，而对于晚期胃癌，目前的治疗选择仍然不足[17]。胃镜是目前胃癌诊断最为有效的方式之一，通过镜下筛查发现异常组织并进行病理活检可确诊胃癌，但作为一种侵入性检查，且操作过程往往引起人体不适和心理畏惧，因此不能作为普查项目被广泛接受，这也是我国胃癌早期诊断率低下的原因之一。目前，寻找高诊断效能的非侵入性胃癌早期诊断指标成为研究热点。

有研究发现lncRNA是胃癌早期的潜在生物标志物，参与胃癌的发生发展进程，并可为胃癌的诊断、治疗及预后判断提供新的途径[18]。还有研究证实lncRNA可通过多种信号通路促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制胃癌细胞凋亡[19]。

本研究显示，lncRNA NEAT1在胃癌患者血清中呈高表达，与MA等[12]在胃癌组织中的研究结果一致，提示lncRNA NEAT1是较有前途的治疗性生物标志物。

既往研究多是在胃癌组织及细胞中进行，鲜有关于血清学的研究。通过查阅文献发现lncRNA也可使用血清或血浆标本检测，血清、血浆取材较组织、细胞方便，创伤小，患者依从性也更高，适用于大多数的临床检测项目。临床生化免疫学项目的检测通常采用血清标本，且标本管中可分离出的血清标本量远多于血浆标本量，因此综合考虑本文采用血清标本进行研究。

本文就lncRNA NEAT1在胃癌患者血清中的相对表达水平进行研究讨论。通过qPCR检测血清中lncRNA NEAT1的相对表达水平，发现胃癌组血清lncRNA NEAT1相对表达水平升高，表明该分子可作为胃癌筛查的潜在生物标志物。临床病理参数分析显示，胃癌患者血清lncRNA NEAT1相对表达水平与患者的性别、年龄无关，而与肿瘤最大径、TNM分期及淋巴结转移有关。上述结果表明血清中lncRNA NEAT1相对表达水平可能与胃癌的侵袭转移过程相关。目前，肿瘤标志物的检测广泛应用于临床，尤其是其联合检测能大大提高早期恶性肿瘤的检出率。《胃癌诊疗指南(2022年版)》[20]推荐使用CEA、CA19-9及CA72-4作为胃癌的诊断及疗效评估、预后判断的肿瘤标志物。然而，在日常工作及查阅文献后发现，CA72-4测定结果易受饮食、药物、痛风、肝肾功能异常、妇科肿瘤等因素的影响，导致结果偏高[21]。CEA、CA19-9是常用的胃肠道肿瘤标志物，且多用于健康体检。本文以CEA、CA19-9两种肿瘤标志物作为研究对象进行相关性分析，结果显示lncRNA NEAT1与CEA、CA19-9均不相关，提示lncRNA NEAT1可能是一种独立新型肿瘤标志物。采用ROC曲线分析诊断效能时发现，lncRNA NEAT1检测胃癌AUC高于CEA和CA19-9,说明lncRNA NEAT1的诊断效能优于CEA、CA19-9,尤其是单独检测时灵敏度达到82.2%,有助于疾病的早期诊断。当三者联合检测时，其AUC高于单项检测，大大提高了诊断效能，可为胃癌的早期诊断、早期治疗提供帮助，所以血清lncRNA NEAT1有望成为胃癌新的辅助诊断标志物。

本文探讨了lncRNA NEAT1作为一种新型的胃癌辅助诊断血清标志物的可能性，旨在提高胃癌的早期诊断效率，并为其作用机制的研究和临床应用提供理论依据，但该分子对于胃癌的预后影响等尚未知，后续可继续深入探究。

参考文献:

[1]王静雷,杨一兵,耿云霞,等.1990—2017年中国胃癌发病､患病及死亡状况趋势分析[J].中国慢性病预防与控制,2020,28(5):321-325.

[19]周永兴,谭观桥,周大为,等.LncRNA FTH1P3通过调控PI3K/AKT信号通路促进胃癌细胞增殖和迁移能力[J].国际检验医学杂志,2022,43(19):2380-2385.

[20]中华人民共和国国家卫生健康委员会医政医管局.胃癌诊疗指南(2022年版)[J].中华消化外科杂志,2022,21(9):1137-1164.

基金资助:国家自然科学基金项目(81271920,81871720);

文章来源:张敏,朱慧婧,张小霞,等.胃癌患者血清lncRNA NEAT1的表达及其意义[J].国际检验医学杂志,2024,45(20):2433-2436+2442.