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左金方靶向特洛细胞抗胃癌的作用机制研究

2024-12-09 28 上传者：管理员

摘要：目的探究特洛细胞（TCs）作为左金方抗胃癌作用的潜在靶标。方法建立N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）联合幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori,H. pylori）的小鼠胃癌动物模型，模型成功后将小鼠分为模型组和左金方高、中、低剂量(1.456、0.728、0.364 g·kg-1)组，对照组不造模。每天ig给药1次，对照组、模型组给予等体积水。第38周收集小鼠胃组织标本，应用透射电子显微镜（TEM）、免疫组化、多重荧光免疫组化（mFIHC）技术对小鼠胃正常组织中TCs的形态、分布及免疫表型进行分析；苏木素-伊红（HE）检测各组小鼠胃病理改变；TEM观察各组小鼠胃中TCs的形态变化；mFIHC检测各组小鼠胃组织中TCs的数量。结果小鼠胃正常组织中，黏膜层TCs数量较少，黏膜下层和肌层中TCs相对较多，TCs的胞体呈长梭形或纺锤形，具有细长伴节状膨大的端足（Tps），与血管、神经和平滑肌伴行交联，形成网状结构；免疫表型为CD34+/PDGFR-α+/CD31-/c-kit-，与人胃组织中的一致。与对照组比较，小鼠胃癌组织中，TCs的形态发生改变，网状结构缺失，分布密度显著下降，数量显著减少（P<0.01）；与模型组相比，左金方组均能改善TCs的变化，高剂量组明显减轻了胃组织的病理损伤，TCs的形态和网状结构逐渐恢复，数量回升，差异有统计学意义（P<0.01）。结论 TCs在小鼠胃组织各层均有分布，其免疫表型为CD34+/PDGFR-α+/CD31-/c-kit-，逆转TCs的缺失可能是左金方抗胃癌作用的重要机制。

关键词：
telocytes
左金方
消化系统疾病
胃癌
靶标
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2022年胃癌的流行病学资料显示，我国胃癌的死亡率居肿瘤死亡率的第3位[1-2]。胃癌明确的治疗靶点人表皮生长因子受体-2(HER2），在晚期胃癌患者（中国）中阳性率远低于12.1%[3]，寻找具有治疗潜力的新靶点和靶向治疗药物，成为了研究的热点和难点。出自《丹溪心法》的左金方，由黄连6两与吴茱萸1两组方，以治疗消化系统疾病（肝火犯胃所致的胃炎、胃溃疡等[4]）、非消化系统疾病（糖尿病、高血压、精神症状等[5]）以及多种肿瘤（如结直肠癌、皮肤肿瘤、乳腺肿瘤、肝脏肿瘤等[6-9]）而引起广泛关注。本课题组前期研究又发现，左金方能诱导胃癌细胞凋亡、抑制胃移植瘤的生长[10]，但机制不明确，限制了左金方的临床新用。特洛细胞（TCs）的研究为胃癌的发病机制以及左金方抗胃癌作用的阐明，提供了新的视角。TCs是近年来发现的一种新型的间充质细胞，与肝癌、乳腺癌、基底细胞癌、前列腺癌等肿瘤的发生、发展密切相关[11-14]。本课题组前期研究证实了人胃中TCs的存在，并发现TCs的丢失可能是胃癌发生的关键因素[15]。左金方是否通过靶向TCs发挥了抗胃癌的作用，未见文献报道。

本研究采用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）联合幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）建立了小鼠胃癌动物模型，以小鼠的胃组织标本为研究对象，通过苏木精-伊红（HE）染色对标本进行病理诊断分型，结合透射电子显微镜（TEM）、免疫组织化学（IHC）和多重荧光免疫组化（m FIHC）等技术，动态监测TCs的变化，阐明左金方靶向TCs发挥抗胃癌的作用机制，为临床胃癌治疗新靶标的发现提供新的思路。

1、材料

1.1动物

BALB/c小鼠，SPF级，雌雄各半，体质量18～20 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SYXK（粤）2022-0302。

1.2主要药物与试剂

黄连和吴茱萸均购自康美药业有限公司，由深圳市中医院周红祖主任中药师鉴定，分别为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎和芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.干燥近成熟的果实；牛血清蛋白（货号CF0050，北京金克隆生物技术有限公司）；一抗CD34、血小板衍生生长因子受体-α(PDGFR-α）、CD31、c-kit（货号分别为3569、3174、3528、37805，美国Cell Signaling Technology);HRP生物素标记的二抗（货号abs957，上海优宁维生物科技有限公司）；DAB试剂盒（货号G1212-200T，武汉赛维尔生物科技有限公司）；多重荧光免疫组化试剂盒（货号abs50012，上海爱必信生物科技有限公司）；H.pylori的SS1菌株（sydney strain 1，澳大利亚莫纳什大学，广州中医药大学中药药理室）；MNNG（货号HY-128612，上海皓元医药科技有限公司）

1.3仪器

APS300S组织脱水机、EG1150C石蜡包埋机、RM2016石蜡切片机、HI1210摊烤烘片机、EM UC7超薄切片机（德国Leica公司）；HT7700钨灯丝透射电子显微镜（TEM，日本HITACH公司）；BX51正置荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）。

2、方法

2.1药物制备

取黄连60 g、吴茱萸10 g，加10倍蒸馏水浸泡30 min，按传统方法煎煮3次，每次40 min，滤过后合并滤液，冷冻干燥机干燥，制备左金方冻干粉，1 g干粉中含生药3.98 g。HPLC测定含量，冻干粉中含小檗碱39.85%、巴马汀9.19%、药根碱4.86%、吴茱萸碱0.17%、吴茱萸次碱0.19%[16]。配制成1 mg·m L-1的母液，实验时稀释成所需浓度。

2.2 H.pylori的培养

取H.pylori的SS1菌液100μL，用一次性涂布器涂于培养基上，置85%N2、10%CO2、5%O2的三气培养箱中培养，24 h后将细菌重悬于PBS中，调整至1×109CFU·m L-1。

2.3 MNNG联合H.pylori致小鼠胃癌动物模型的建立及分组给药

小鼠每日ig 100μg·m L-1的MNNG溶液10 m L·kg-1，持续2周，禁食不禁水12 h后，ig 5%碳酸氢钠溶液0.2 m L,30 min后按照每只0.2 m L的剂量ig 1×109CFU·m L-1SS1菌液，连续4次，每次间隔48 h，之后继续ig MNNG溶液2周。经苏木素-伊红（HE）染色后，在光镜下观察到黏膜上皮细胞不典型增生、腺管结构紊乱等典型胃癌表现证明胃癌造模成功。模型成功后将小鼠分为模型组和左金方高、中、低剂量（1.456、0.728、0.364 g·kg-1）组，对照组不造模。每天ig给药1次，对照组、模型组给予等体积水。第38周收集小鼠胃组织标本。

2.4标本处理

2.4.1石蜡组织标本制作

选取小鼠胃组织标本，按面积约15 mm×15 mm、厚度约10 mm取材，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，随后置于4%多聚甲醛中固定24 h以上，目的部位组织修平整后，梯度脱水，包埋、制成石蜡组织标本。

2.4.2电镜标本制作

取样针取样后，使用2.5%戊二醛和1%锇酸进行固定，梯度脱水，包埋过夜，固化。

2.5 HE染色

石蜡切片机上切片，片厚4μm，连续切片脱蜡至水，苏木素染色，1%的盐酸乙醇分化，返蓝，伊红染色，梯度脱水，中性树胶封片，显微镜镜检。

2.6 TEM观察

超薄切片制备70 nm的薄片，双染色剂3%醋酸铀-枸橼酸铅染色，于电压为80 k V的透射电子显微镜下观察、拍片。

2.7免疫组织化学（IHC)

石蜡组织标本连续切片，常规脱蜡至水，柠檬酸盐溶液抗原修复，0.3%甲醇-过氧化氢水溶液灭活，牛血清白蛋白（BSA）封闭，分别加入一抗CD34(1∶100）、PDGFR-α(1∶400）、c-kit(1∶150）和CD31(1∶1 600),4℃孵育过夜，复温，加一抗放大剂，HRP生物素标记的二抗孵育，DAB避光显色，苏木素复染，分化，脱水，封片，阅片。

2.8多重荧光免疫组化（m FIHC)

常规样本制备，微波抗原修复，灭活，BSA封闭，第1种一抗（CD34、PDGFR-α、c-kit、CD31）室温保湿震荡孵育2 h；二抗孵育，第1种荧光染色放大信号（TSA520或TSA650），抗体洗脱，重复抗原修复，封闭，孵育目的蛋白及其对应二抗和染料，DAPI染核，滴加抗荧光衰减封片剂封片，阅片。

2.9统计学方法

结果以表示。采用SPSS 22.0软件进行数据的统计与分析，2组间比较选择t检验方法。

3、结果

3.1 TEM观察小鼠胃中TCs的存在

选取小鼠胃正常组织标本，采用TEM技术确定小鼠胃中TCs的存在。对小鼠胃正常组织中各层——固有层、黏膜肌层、黏膜下层、肌层及浆膜层进行观察，发现均有TCs的存在，TCs胞体呈梨形、长梭形或纺锤形。固有层中，TCs包绕腺体细胞，形成异型交联（图1-A）。黏膜下层中，TCs胞体呈长梭形或纺锤形，伴有细长的端足（Tps），有一条细长伴有节状膨大的突起，细长部和膨大部呈念珠状（图1-B）。肌层中，TCs与血管、神经和平滑肌伴行交联，形成网状结构（图1-C）。

图1 小鼠胃正常组织固有层（A）、黏膜下层（B）、肌层（C)TEM比较（×1 000)

3.2 IHC检测小鼠胃中TCs的表型

选取小鼠胃正常组织标本，以CD34、PDGFR-α、CD31、c-kit为标记物，通过IHC，研究小鼠胃组织中TCs的免疫表型。结果显示小鼠胃正常组织中TCs的免疫表型为CD34+/PDGFR-α+/CD31-/c-kit-（图2），与人胃中TCs免疫表型一致[15]。

3.3 m FIHC观察小鼠胃中TCs的分布和网状结构

选取小鼠胃正常组织标本，采用m FIHC观察TCs在各层的分布与网状结构。结果显示（图3），在小鼠胃各层TCs的数量、分布和网状结构存在很大差异，固有层TCs数量较少，仅有少量TCs包绕腺体发生异型交联，形成网状结构；黏膜肌层中TCs与肌细胞伴行；黏膜下层中TCs数量较多，胞体延伸方向与黏膜下层走行一致，Tps与血管内皮细胞形成异型交联，并包绕神经结缔组织；肌层中分布大量TCs，其多与平滑肌细胞伴行，形成网状结构。

图2 小鼠胃正常组织IHC结果（×400)

图3 小鼠胃正常组织m FIHC结果（×400)

3.4 HE染色观察小鼠胃病理改变

如图4所示，对照组胃组织标本中各层结构完整，未观察到明显炎症细胞浸润；模型组胃组织标本可见黏膜上皮细胞异型性增生，癌细胞排列紊乱，呈柱状、立方状或扁平状增生，固有层中可见扩张的或裂隙状分枝小管样腺体，呈现胃癌病理改变，说明胃癌模型制作成功；与模型组比较，左金方低、中剂量组癌细胞异型性较明显，高剂量组中，胃固有层可见残存腺体结构，肿瘤细胞异型性低，提示随着左金方给药剂量的增加，胃部病理损伤逐渐减轻。

3.5 TEM观察小鼠胃中TCs的形态变化

如图5所示，模型组TCs的胞体由梭形变为球形，甚至发生破裂，Tps缩短、断裂；与模型组比较，左金方低、中剂量组，TCs呈椭圆形或梨形，Tps长度逐渐增加，节状突起恢复，高剂量组的改变更为明显，表明随着左金方药物剂量的增加，TCs的形态结构趋于正常，网状结构逐渐恢复。

3.6 m FIHC检测小鼠胃中TCs的数量变化

如图6所示，模型组中TCs同型交联和异型交联减少，网状结构缺失，TCs数量显著减少，与对照组比较有显著统计学差异（P<0.01）（图7）；在左金方低、中、高剂量组中，随着左金方药物剂量的增加，TCs数量呈增多趋势，网状结构逐渐恢复，高剂量组改变更为明显，可见TCs包绕血管及周围细胞形成异型交联及网状结构，TCs数量显著增多，与模型组相比具有统计学差异（P<0.01）。

图4 HE染色（×40)

图5 TEM观察（×1 000)

图6 m FIHC（×400)

图7 TCs数量比较（x±s,n=10)—

4、讨论

近年来胃癌治疗方法取得很大的进步，靶向治疗联合化疗虽然可以改善包括胃癌在内的实体瘤患者的预后，但靶点阳性患者比例低，不能明确特定靶点人群的特征，无法做到精准治疗。因此寻找更多有治疗潜力的新靶点成为研究的热点和难点。中药复方治疗癌症具有防治结合、整体调治等优点，但是机制的阐明尚不清晰。

TCs是近年来新发现的一种新型间充质细胞，TCs参与了肝癌等多种肿瘤的发生、发展过程[10-13]。有最新药物研究表明，甲磺酸伊马替尼调控TCs治疗胰腺癌[17]，小檗碱通过调控TCs发挥治疗心血管疾病的作用[18]，提示TCs可能是药物治疗的潜在靶标，左金方是否通过靶向TCs发挥了抗胃癌的作用，国内外未见文献报道。

本研究首次证实了TCs在小鼠胃中的存在，其免疫表型为CD34+/PDGFR-α+/CD31-/c-kit-，与人胃中TCs的免疫表型一致[10]；通过TEM技术观察到小鼠胃中TCs胞体呈长梭形或纺锤形，具有细长伴节状膨大的Tps，并与血管、神经与平滑肌伴行并交联呈网状结构。m FIHC显示小鼠胃组织黏膜层中TCs数量较少，包绕腺体并与黏膜肌连接呈网状结构，黏膜下层中TCs数量最多，胞体与黏膜下层走行一致，并包绕血管、神经，肌层中TCs包绕在平滑肌细胞周围并彼此交联。

通过建立MNNG联合H.pylori的小鼠胃癌动物模型，发现胃癌模型组TCs的胞体由梭形变为球形，甚至发生破裂，同时Tps缩短、断裂，同型交联和异型交联减少，网状结构缺失，TCs数量显著减少，与对照组相比有统计学差异；在胃癌左金方组的小鼠组织标本中，TCs的胞体呈椭圆形，胞体发生破裂的TCs减少，Tps长度较胃癌模型组增加，TCs数量增多，与胃癌模型组相比有统计学差异。以上结果表明随着左金方给药剂量的增加，胃部病理损伤逐渐减轻。TCs的形态结构趋于正常，网状结构逐渐恢复，TCs数量明显增多，与模型组相比具有明显统计学差异。

本研究结果提示，左金方靶向TCs发挥了抗胃癌的作用机制，为胃癌机制的阐明提供了新的视角，为临床胃癌治疗新靶标的发现提供了新的思路。进一步将进行胃TCs的原代培养，通过左金方对TCs的直接作用，为TCs作为左金方抗胃癌的新靶标提供实验依据。阐明TCs在胃癌发病机制及治疗机制中的作用，为从中医药理论出发，阐明胃癌发生发展的中医基础以及中药治疗提供有力的支撑，Tcs深度研究将为中医药理论指导下的中医药的现代研究提供新的途径。

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基金资助:深圳市基础研究面上项目(JCYJ20220531102208019);深圳市药学会医院药学研究基金(恒瑞基金)(SZ2022A25);深圳市医疗卫生三名工程项目(SZZYSM202111002); 深圳大学2024年度聚徒项目(聚徒+学术);