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多功能纳米载体输送疏水性化疗药物对前列腺癌细胞的抵抗作用研究

2020-08-24 452 上传者：管理员

摘要：目的:使用新型纳米载体:叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)输送紫杉醇(PTX)特异性促PC-3细胞(人前列腺癌细胞)凋亡，初步探讨其进入PC-3细胞的效率及对体外细胞毒性作用。方法:构建纳米聚合物叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)后，测定载体的药物包裹率、pH响应性和不同浓度的毒性;通过MTT实验、流式细胞术等试验对叶酸靶向PEGPAsp(DIP-co-BzA)传输化疗药PTX至PC-3细胞的靶向性进行研究。结果:由于叶酸配体对叶酸受体的亲和力，体外培养的PC-3细胞对叶酸靶向组PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX的摄取量明显高于非靶向组，这些靶向型PEG-PAsp(DIP-coBzA)/PTX在pH≈7.4的生理条件下具有良好的化学和胶体稳定性，包埋在胶束中的PTX在pH≈5.0环境中能完全释放。换言之，这种聚合物胶束具有pH响应的核心，增强了药物在酸性环境中的释放。结论:在前列腺癌治疗中叶酸靶向pH响应聚合物胶束为疏水性PTX的转运提供了一种有效的途径。

关键词：
前列腺癌
叶酸
抗肿瘤
紫杉醇
聚胶束
靶向治疗
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前列腺癌是常见的恶性肿瘤，欧美地区是男性肿瘤死亡的第二大原因[1,2]。对于早期局限性前列腺癌患者，最有效的方法有前列腺根治性切除术和根治性放疗[3,4]。但由于前列腺癌发病隐匿，其中约75%的前列腺癌患者在确诊时，已进展为晚期，肿瘤细胞已出现远处转移。对于晚期前列腺癌患者，尤其当其发展为雄激素抵抗后，治疗方案往往仅能选择抗肿瘤药物化疗，但治疗效果欠佳。目前制约化疗药物抗肿瘤治疗的因素主要有:(1)化疗药物往往水溶性较差，使得抗肿瘤药物不能有效地通过体内的液体循环运输到肿瘤中;(2)在血液中半衰期短、靶向性差、副作用大等。这些因素都制约了临床中化疗药物的使用[5]。本研究使用新型叶酸靶向PH响应的纳米聚合物作为化疗药物的载体，输送紫杉醇(PTX)特异性促PC-3细胞凋亡，并初步探讨其进入PC-3细胞的过程和体外的细胞毒性作用。

1、材料和方法

1.1主要材料

聚合物叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX由中山大学化工学院自主设计;人前列腺癌细胞PC-3细胞(中国SIBS);MTT检测试剂盒;胎牛血清;1640培养基;96孔板;叶酸等。

1.2主要设备

超净台、酶标仪InfiniteF200;倒置荧光显微镜;低温高速离心机;CO2恒温培养箱等。

1.3检测聚合物体外释放药物效果

(1)将PTX与叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)复合后分成两份，分别将其pH值调为5.0及7.4，并维持。(2)将样品装在透析袋(14000Da)中，置于100mLPBS缓冲液(相同pH值)中。(3)将该缓冲液置于37摄氏度，每分钟75转下，在定时取样，之后往该系统中加入等体积等pH值的缓冲液。(4)通过HPLC测定样品浓度，计算各时间的PTX释放量。以时间-累积释放量作图(样品量为20μL)，得出聚合物释放PTX的曲线图。

1.4体外聚合物被摄取效率测定

采用流式细胞术评价尼罗红标记的FA靶向胶束和非靶向胶束的效率。实验分为空白对照组、FA靶向组、非靶向组和FA靶向聚合物+FA组。PC-3细胞接种于6孔板上，每孔3×105个细胞，置于2毫升完整的RPMI-1640培养基中，在37℃、5%CO2增湿的环境中培养24小时。用PBS清洗细胞，用2毫升缺乏叶酸的RPMI-1640代替每孔培养基，在37°C下培养4小时，以0.1μg/mL的尼罗红浓度加入含尼罗红标记的FA靶向或非靶向胶束的无血清培养基进行细胞培养，在37℃处理1h后，用胰蛋白酶处理细胞并用冷PBS洗涤两次，分别离心1500r/min,5min，再悬浮于500μL磷酸盐缓冲液(PBS)中，用流式细胞仪检测各组的转染效率。

1.5细胞毒性作用试验

(1)用胰蛋白酶收集对数生长期的前列腺癌PC-3细胞。(2)将细胞接种到96孔板上(每孔5×103个/100μL)，在恒温培养箱中孵育细胞24h。(3)细胞完全贴壁后，使用无叶酸的1640培养基将空白载体叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)配成1、10、50、100、200、500和800μg/mL等浓度，将叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX、叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX+游离叶酸(FA,1mM),PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX及游离PTX中的PTX的最终浓度调整为1、10、100、500、1000和5000ng/mL，用上述培养基替换原细胞培养基。各设5个复孔。(4)培养板在37°C下轻轻摇动并孵育2h。用PBS洗涤细胞，更换新鲜1640培养基中再培养48h，然后在每个孔中加入10μLMTT溶液，避光培养4h后，DMSO，振荡10min。(5)用酶标仪检测吸光度。

1.6统计学方法

所有实验重复至少三次，用SPSS17.0软件对数据进行统计分析，数据用(±s)表示，用方差分析检验组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1聚合物释放PTX检测

测定叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX在不同pH环境下(7.4和5.0缓冲液中)的释放速率。我们可以发现聚合物在pH7.4中释放PTX少，累积释放率小于20%(见图1)。而当环境pH降到5.0时，聚合物快速释放PTX。说明，该聚合物可减少药物在血液中(pH≈7.4)的释放，当聚合物到达特定的环境(pH≈5.0)时PTX可大量释放，从而减少化疗药物的毒性和提高其治疗效果。

图1pH5.0和pH7.4时纳米胶束内包封的PTX从聚合物胶束样品中的体外释放曲线

2.2PC-3细胞摄取聚合物的效率

采用流式细胞术检测尼罗红标记的叶酸靶向和非靶向束PEG-PAsp(DIP-co-BzA)BzA聚合物对PC-3细胞的转染效率，并以等量PBS处理的细胞为对照。如图2和图3所示，当细胞与靶胶束孵育1h时，尼罗红的平均荧光强度高达60000，而与非靶向聚合物孵育的细胞中尼罗红的平均荧光强度仅为30000左右。而在过量游离叶酸(1mM)存在下，叶酸靶向聚合物孵育的细胞摄取量降低到相当于非靶向聚合物的低水平(约40000)。结果表明，尼罗红标记的叶酸靶向聚合物PEG-PAsp(DIP-co-BzA)对PC-3细胞的荧光作用明显强于非靶向聚合物对PC-3细胞的荧光作用，表明该聚合物能在叶酸受体介导的内吞作用下被PC-3细胞有效摄取(P<0.05)。

图2流式细胞仪分析显示尼罗红的荧光高度

图3流式细胞仪分析显示尼罗红的平均荧光强度

2.3细胞毒性试验结果

用MTT法检测无PTX的空白叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)聚合物、叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX(Targeted组)、叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX+游离叶酸(Targeted+freeFA组)、非靶向PEG-PAsp(DIP-coBzA)/PTX(Non-targete组)、游离PTX(freePTX组)在PC-3细胞系中的体外毒性。浓度依赖性的研究(图4)表明，随着聚合物浓度的增加，无PTX的空白叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)聚合物的细胞毒性也增加，但当聚合物浓度达到50μg/mL时，细胞活力仍然很高(92.09±2.42)%。说明，该空白载体具有良好的生物相容性、对前列腺癌PC-3细胞的毒性作用轻微。图5表明，叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-coBzA)/PTX在抑制PC-3细胞增殖方面比叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX+游离叶酸(FA)、非靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX、游离PTX都更有效。

图4无PTX空白叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)聚合物的细胞毒性

图5各组聚合物不同浓度的细胞毒性

3、讨论

本文应用了一种新型叶酸靶向多功能聚合物载体，肿瘤细胞的表面往往表现出叶酸受体的过表达，而我们将此作为载体的靶点，特异性识别叶酸受体并结合，传输PTX至PC-3细胞内释放。药物的释放动力学直接影响药物的治疗效率和毒性[6]。该叶酸靶向pH响应的PEG-PAsp(DIP-coBzA)聚合物在与血液循环(pH≈7.4)相同中性pH下有“关闭”药物释放的能力，而在酸性环境(溶酶体pH≈5.0)中则表现出“打开”能力。药物释放特性的研究结果表明，聚合物的pH可调PAsp(DIP)夹层在pH7.4时能有效地关闭药物释放，而在pH5.0时能打开药物释放。如图1所示，在pH7.4环境中聚合物的PTX只有少量释放。而在pH5.0环境下，由于PAsp(DIP)的层间溶解作用，PTX迅速释放，这不仅提高了PEG-PAsp(DIP-co-BzA)在中性pH环境下的稳定性，而且还改善了药物在聚合物中的控释性能。体外细胞摄取研究表明，在PC-3细胞孵育1小时靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)组的平均荧光强度高达约60000。然而，在相同条件下，非靶向组的尼罗红平均荧光强度仅为30000，证实了叶酸受体过度表达的人PC-3细胞对叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)的吸收较非靶向组载体明显增加。由于细胞摄取和药物释放动力学的改善，叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX在体外表现出比非靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX和游离PTX更有效的抗增殖作用(图3b)。

在这项研究中，我们使用了一种新的叶酸靶向聚合物载体，该载体内置了一个pH可调的“开关”触发器，用于控制细胞内的药物释放，并能特异性地将PTX传递给叶酸受体过表达的前列腺癌细胞内。叶酸配体促进了PC-3细胞对PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX的内吞，pH敏感的PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX聚合物在与血液循环(7.4)相同的中性pH下表现出“关闭”药物释放的能力，相反，它在酸性环境(溶酶体pH≈5.0)中“打开”药物释放。尼罗红标记法清楚地阐明pH值可调的药物释放的过程。并且叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA)/PTX具有比游离PTX和非靶向PTX更有效的抗增殖作用。这项研究表明，叶酸-聚乙二醇-聚天冬酰胺(N,N-二异丙基乙二胺)-苄胺(叶酸靶向PEG-PAsp(DIP-co-BzA))三嵌段共聚物纳米胶束有望作为叶酸靶向抗肿瘤药物载体，以提高PTX治疗晚期前列腺癌的疗效和降低全身毒性。

黄星华,吴上超,陈浩栋,周建华.多功能纳米载体输送疏水性化疗药物抗前列腺癌细胞作用的研究[J].黑龙江医药,2020,33(04):735-738.

基金:深圳市科技创新委深圳市科技计划项目(编号:JCYJ20170307104818517);项目名称:叶酸靶向纳米载体负载紫杉醇及SPIO治疗前列腺癌