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神经元抑制性沉默因子的表达水平与卵巢癌的相关性研究

2020-08-24 195 上传者：管理员

摘要：目的:研究神经元抑制性沉默因子(NRSF)的表达水平与卵巢癌的相关性。方法:NRSF在正常卵巢和卵巢癌细胞中的表达是通过定量PCR,westernblotting法以及免疫组化等方法检测的。免疫荧光法等可以用来研究NRSF影响卵巢癌细胞增殖的机制。结果:研究结果表明NRSF在卵巢癌细胞中的表达水平显著升高，下调NRSF表达水平可以抑制卵巢癌细胞的增殖，且其表达水平与卵巢癌病人的生存时间成反比。NRSF还能通过调节海马通路(hippopathway)的基因转录来影响卵巢癌细胞增殖。结论:我们的研究表明NRSF与卵巢癌的进展有关，NRSF可能会成为一个早期诊断卵巢癌的标志物，并且抑制NRSF的表达可能会成为治疗卵巢癌的有效方法。

关键词：
NRSF
卵巢癌
海马通路
相关性
表达水平
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自1970年代以来，由于卵巢癌发生率减少及治疗手段的改善，卵巢癌病人的死亡率也减少了30%[1]，但是死亡率较高，约为5%，这是因为卵巢癌病人缺乏典型的早期症状及高特异性的肿瘤标志物。因此，寻找卵巢癌特异性肿瘤标志物迫在眉睫。

在正常的组织细胞中，细胞的增殖和死亡处于动态平衡。但是，恶性肿瘤细胞打破了这种平衡，并获得了无限制的自我复制及抑制细胞凋亡的能力[2]。近些年，研究发现海马通路在加速细胞死亡及抑制细胞增殖等方面发挥着极为重要的作用。在哺乳动物细胞中，激酶是信号通路的核心物质，如LATS1/2激酶可催化转录共激活因子YAP蛋白(Yes-associatedprotein)和TAZ(PDZ-bindingmotif)磷酸化，他们均为海马通路下游的两个重要因子[3]。当磷酸化作用停止后，YAP/TAZ可以转移至细胞核并与TEAD转录因子结合，通常激活靶蛋白基因包括一些分泌蛋白[4]，虽然海马通路的核心机制已被人类所知，但是目前对这条通路的调节机制了解甚少。

最初，神经元抑制性沉默因子(NRSF)是作为一种神经元形成和分化的抑制因子被科学家们所发现，它是一种锌指蛋白包括八个锌指结构和两个抑制因子结构域从而对靶向基因进行调节[5]。最近研究表明，它的表达及功能不同于转录阻遏蛋白基因。在小细胞肺癌中，NRSF水平下调及表达缺失与肿瘤转移复发有关。所以可见，NRSF的功能很复杂，即使已经进行了其他恶性肿瘤领域的诸多研究，也不能推断出NRSF在卵巢癌中的表达及功能。

1、材料和方法

1.1材料

人类卵巢癌细胞株(SK0V3,OVCAR-3,CaoV-3,T0V-21G,ES2,OV-90,PA-1)及人卵巢表面上皮细胞均购买于美国ATCC公司及DMEM公司。组织标本来自山东省威海市妇女儿童医院，并经病人及家属同意。

1.2方法

1.2.1定量PCR

全部RNA使用INVITROGEN试剂盒进行分离。使用ABI7500快速系统进行PCR反应。所有的PCR进行35个循环。

1.2.2Westernblotting法

Westernblotting方法使用NRSF抗体，p-MST1抗体，MST1抗体，p-LATS1抗体，LATS1抗体，p-YAP抗体，YAP抗体。

1.2.3免疫组化法

组织用石蜡包埋并切成5um小块，二甲苯溶液脱石蜡，蒸馏水水化。内源性过氧化物酶在含有3%的过氧化氢的甲醇溶液中孵化20分钟。抗原的修复使用柠檬酸盐缓冲液在高压灭菌锅中煮沸3分钟后室温冷却。在4℃，用NRSF一抗进行孵化过夜，使用IgG二抗室温下孵化30分钟。抗原抗体复合物通过生物素过氧化物酶法进行检测。

1.2.4免疫荧光法

细胞被置于盖玻片，24小时后，4%的多聚甲醛固定细胞。0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚处理15分钟，用抗YAP抗体在4℃过夜处理。这些细胞在室温内用二抗处理1小时。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行染色，激光扫描显微镜获得图片。

1.3数据分析

每一个实验均被重复3次。使用SPSS20.0数据分析包进行数据分析，t检验分析其统计学意义。结果通过平均值±偏差计算所得，P<0.05有统计学意义。

2、结果

2.1NRSF在卵巢癌细胞中过表达，且其表达水平与卵巢癌病人生存期成反比

为了研究NRSF在卵巢癌恶化过程中所发挥的作用，NRSF在卵巢癌中表达的信息来自基因表达信息库(GEO)。我们研究了这些资料，从GSE66957到GSE18520，并且发现NRSF在卵巢癌组织中明显高于正常卵巢组织(如图1A和B所示)。

图1肿瘤组织中的NRSFmRNA的表达明显高于正常卵巢组织

我们使用Kaplan-Meierplotterdatasets分析了NRSF对卵巢癌进展的影响。NRSF高表达常提示患者预后差，生存期短，如图2所示。

图2NRSF与卵巢癌病人的生存期的相关性分析

通过我们对卵巢癌细胞株及组织中的NRSF表达的研究，定量PCR及westernblotting试验均提示在7个卵巢癌细胞株中NRSF的表达明显高于正常卵巢上皮细胞。通过使用qPCR及westernblotting等方法研究表明在新鲜的卵巢癌组织标本中NRSF基因的mRNA转录及蛋白表达比在正常卵巢组织标本中明显增加，如下图3所示。

图3NRSF的mRNA表达

除此以外，NRSF的表达被免疫组化法进一步证实，使用了3个正常卵巢标本，7个卵巢癌标本。这些实验结果表明，卵巢癌细胞中NRSF的表达明显增加，且NRSF的表达与卵巢癌患者生存期成反比，如图4所示。

图4免疫组化法检测NRSF的表达

2.2下调NRSF表达会激活海马通路

我们免疫荧光法实验表明NRSF沉默细胞中YAP主要分布在细胞质中，并使用一种NRSF过表达细胞中的海马通路抑制剂，维替泊芬(一种光增敏剂)。结果表明，下调NRSF可激活海马通路，其抑制剂能减弱NRSF对细胞增殖的促进作用，故海马通路是增强NRSF对细胞增殖作用的必要条件。综上所述，下调NRSF的表达通过激活海马通路可抑制卵巢癌细胞的增殖。

3、讨论

目前的研究中，我们发现NRSF在卵巢癌细胞株和组织中明显升高。进一步的研究表明NRSF通过海马通路加速卵巢癌细胞的增殖。下调NRSF可以抑制海马通路中下游基因的表达[6]。卵巢癌是妇科肿瘤中死亡率最高的疾病[7]。早期卵巢癌通常是无明显症状的，晚期患者会出现腹部肌肉紧张，腹部包块，胃肠症状及癌细胞转移压迫周围器官等症状。由于没有明显的早期症状及有效的诊断标志物，大约60～70%的病人被诊断为卵巢癌时，就已经为Ⅲ～Ⅳ期或已有腹部转移[8]。我们的研究中发现在卵巢癌细胞中NRSF的表达明显升高，并且其下调可抑制卵巢癌细胞增殖。我们的研究表明NRSF可能不仅为诊断标志物，可能也会提供治疗卵巢癌的有效方法。

NRSF的表达在不同类型癌细胞中可能升高或下调。据报道NRSF表达减少可能成为一种诊断胆管癌，小细胞肺癌的诊断标志物[9]。以上的研究表明NRSF在肿瘤进展过程中起到很复杂的作用。在卵巢癌细胞中，我们发现NRSF表达上调，海马通路参与细胞增殖，凋亡，细胞连接，细胞极化，细胞功能状态，癌细胞免疫，血管生成。海马通路失调会诱发多种严重疾病，包括癌症[10]。

在我们的研究中，NRSF可以激活海马通路的基因转录增强卵巢癌细胞的增殖。此外，海马通路抑制剂维特波芬可以阻断海马通路来抑制细胞增殖，故阻断海马通路可能是一种治疗卵巢癌的有效方法。尽管如此，在海马通路抑制剂进入临床使用前尚需要更多的证据。下一步，我们将使用异种移植肿瘤的模型实验。

参考文献：

[1]孙颖.卵巢癌组织与肿瘤相关巨噬细胞之间的关系及预后的影响[J].中国妇幼保健,2018,33(24):5950-5952.

[2]周琳,何秀萍.卵巢癌形成､诊断及治疗的研究进展[J].中国生育健康杂志,2018,29(5):491-493.

[3]李艳丽,王义舫.YAP与miRNA-214在乳腺癌中的表达及其与临床病理特征和预后的关系[J].临床误诊误治,2018,31(12):62-66.

[4]王志强,贺璇,周英琼.YAP在肿瘤发生发展中的作用[J].中外女性健康研究,2018,(4):9-10.

[5]王小飞,于盼盼,陆佩华.NRSE与NRSF及其对神经元特异性基因表达的调控作用[J].生物化学与生物物理进展,2005,32(7):595-599.

[6]杨彩虹,孟焕然,万颖,等.Hippo通路相关蛋白在卵巢癌组织中的表达及其临床意义[J].宁夏医科大学学报,2016,38(11):1278-1281.

[7]孙红军,曲宏晶.早期卵巢癌筛查研究新进展[J].黑龙江医药,2013,26(3):397-400.

[8]林丽,谢娟华,王伶俐,等.探究糖类抗原125,糖类抗原199和癌胚抗原联合检测在卵巢癌诊断中的临床意义[J].黑龙江医药,2016,29(4):716-717.

[9]张顺今,刘巍,李委佳,等.癌相关基因NDRG家族的研究进展[J].中国优生与遗传杂志,2014,22(07):1-4.

[10]明瑜琳,张玮.Hippo-YAP信号通路与卵巢癌的相关性研究[J].中国妇产科临床杂志,2018,19(5):474-475.