食管癌(esophagus cancer)是一种复杂的疾病，食管癌主要有2种组织学类型，即食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌，中国ESCC患者占所有食管癌患者的90%[1]。长链非编码RNA (long non-coding, lncRNA)被认为是一类新的转录本，其长度为200个核苷酸，lncRNAs与ESCC的发生进展和转移密切相关[2]。研究表明，lncRNA OIP5-AS1的高表达可促进食管癌的放射抵抗[3]。研究证实，LncRNAs可作为miRNA的竞争内源性RNA,参与微小RNA(micro RNA, miRNAs)对下游靶基因的靶向调控作用[4]。本研究通过体外实验探究OIP5-AS1对ESCC细胞恶性生物学行为的影响，并探讨其下游分子机制。

一、材料与方法

1 材料

细胞人食管癌细胞Eca109、EC9706、TE-1及人正常食管上皮细胞HET-1A,均购自美国ATCC公司。

试剂RPMI-1640培养基，上海爱必信生物科技公司生产；Lipofectamine 3000 转染试剂，北京兴怡雅创生物技术有限公司生产；Trizol试剂，上海晶抗生物工程有限公司生产；反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)试剂盒，均为上海烜雅生物科技有限公司生产；Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma virus oncogene, KRAS)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)一抗试剂，均为英国Abcam公司产品；双荧光酶报告基因检测试剂盒，上海烜雅生物科技有限公司生产；细胞计数试剂盒-8(cell coun-ting kit, CCK-8),南京沃博生物科技有限公司生产；原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl trans-ferase mediated nick end labeling, TUNEL)凋亡检测试剂盒，武汉科斯坦生物科技有限公司生产。引物及质粒，均由上海碧云天生物技术公司提供。

仪器FlexA-200全波长酶标仪，杭州奥盛仪器有限公司产品；PikoReal RT-qPCR仪，美国赛默飞世尔科技有限公司产品；MF53-N荧光显微镜，广州市明美光电技术有限公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养[5]5]

人食管癌细胞系(Eca109、EC9706、TE-1)和正常的HET-1A食管上皮细胞系均在含有添加10%胎牛血清及1%双抗(青-链霉素)的RPMI-1640培养基中并将培养基置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每隔1 d更换培养液。

2.2 细胞转染[6]6]与细胞分组

将TE-1按照每孔5×104个细胞的标准接种于6孔板中，根据实验要求将RE-1细胞随机分为对照组、si-NC组、si-OIP5-AS1组、si-OIP5-AS1+NC inhibitor组、si-OIP5-AS1+miR-129 inhibitor组、NC mimic组、miR-129 mimic组、miR-129 mimic+Vector组、miR-129 mimic+KRAS组。对照组细胞为正常培养的细胞，si-NC组、si-OIP5-AS1组、NC mimic组、miR-129 mimic组细胞待细胞融合至65%左右时用Lipofectamine 3000转染试剂分别将si-NC、si-OIP5-AS1、NC mimic、miR-129 mimic转染至细胞；si-OIP5-AS1+NC inhibitor组细胞用转染试剂将si-OIP5-AS1、NC inhibitor共转染至细胞；si-OIP5-AS1+miR-129 inhibitor组细胞将si-OIP5-AS1、miR-129 inhibitor共转染至细胞；miR-129 mimic+Vector组细胞将miR-129 mimic、Vector共转染至细胞；miR-129 mimic+KRAS组细胞分别将miR-129 mimic、KRAS转染至细胞，转染48 h后检测转染效率并检测相关指标。

2.3 RT-qPCR实验检测HET-1A、Eca109、EC9706、TE-1细胞中相关基因的表达水平[6]6]

取HET-1A、Eca109、EC9706细胞及分组处理后的TE-1细胞，提取各细胞中总RNA(Trizol法),然后用反转录试剂盒将RNA转录为模板DNA(cDNA),然后进行RT-qPCR扩增，并以U6和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase, GAPDH)为内参，以2-ΔΔCt法进行计算各细胞中相关基因相对表达量。

2.4 蛋白质印迹实验检测细胞中KRAS、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达水平[7]7]

收集HET-1A、Eca109、EC9706细胞及分组处理后的TE-1细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)冲洗后加入放射免疫沉淀分析裂解液裂解细胞，离心(1.2×104 r·min-1,15 min)后取上清液，用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并转至聚偏二氟乙烯膜，用5%脱脂奶粉封闭膜，1 h后分别加入一抗稀释液(稀释比均为1∶1 000),4 ℃孵育过夜后用二抗稀释液(1∶3 000)进行孵育1 h(37 ℃),然后进行增强化学发光试剂显影后采集图像并分析灰度值。

2.5 CCK-8实验检测细胞的增殖情况[8]8]

取对数期生长的各组TE-1细胞，然后胰酶消化后接种在96孔板中(每孔接种3 000个细胞),培养贴壁后按照上述分组进行转染，并设置空白对照组，然后分别在培养24、48、72 h后每孔加入CCK-8试剂10 μL,在室温下避光培养2 h后用酶标仪检测450 nm波长下的光密度(optical density, OD)值。

2.6 TUNEL实验检测各组细胞的凋亡情况

取各组细胞，胰酶消化后收集细胞沉淀，用PBS重悬后调整细胞密度并制备细胞爬片，参照文献[9]的方法进行操作，用荧光显微镜观察，并计算TUNEL阳性细胞率。

3 统计学处理

用SPSS 25.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用

表示，多组间比较用one-way ANOVA分析，2组间比较用LSD-t检验。

二、结果

1 食管癌细胞中OIP5-AS1、miR-129、KRAS表达情况

与HET-1A细胞比较，Eca109、EC9706、TE-1细胞中OIP5-AS1、KRAS表达水平均显著上调，miR-129表达水平均显著下降(均P<0.05);且在TE-1细胞中OIP5-AS1、KRAS上调水平最高，miR-129下调水平最低，因此后续实验选择TE-1细胞作为后续研究细胞。结果见表1。

2 敲低miR-129减弱si-OIP5-AS1对食管癌细胞增殖的影响

表1 各组细胞中OIP5-AS1、miR-129、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)表达的比较

表2 各组TE-1细胞增殖、凋亡及miR-129、OIP5-AS1表达的比较

对照组细胞为正常培养的细胞；si-NC组、si-OIP5-AS1组分别将si-NC、si-OIP5-AS1转染至细胞；si-OIP5-AS1+NC inhibitor组细胞使用转染试剂将si-OIP5-AS1、NC inhibitor质粒共转染至细胞；si-OIP5-AS1+ miR-129 inhibitor组细胞将si-OIP5-AS1、miR-129 inhibitor质粒共转染至细胞。

分别与对照组、si-NC组比较，si-OIP5-AS1组和si-OIP5-AS1+NC inhibitor组细胞24、48和72 h的OD值及OIP5-AS1表达水平均显著降低，而TUNEL阳性细胞率及miR-129表达水平均显著升高(均P<0.05);与si-OIP5-AS1+NC inhibitor组比较，si-OIP5-AS1+ miR-129 inhibitor组细胞24、48和72 h的OD值及OIP5-AS1表达水平均显著增加，而TUNEL阳性细胞率及miR-129表达水平均显著降低(均P<0.05),见表2。

3 敲低miR-129减弱si-OIP5-AS1对食管癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关蛋白表达的影响

对照组、si-NC组、si-OIP5-AS1组、si-OIP5-AS1+NC inhibitor组、si-OIP5-AS1+ miR-129 inhibitor组的E-cadherin蛋白相对表达水平分别为0.15±0.01、0.16±0.02、0.60±0.04、0.59±0.09和0.34±0.04,N-cadherin蛋白相对表达水平分别为0.93±0.09、0.97±0.11、0.36±0.04、0.37±0.06和0.80±0.06,Vimentin蛋白相对表达水平分别为0.91±0.06、0.89±0.12、0.28±0.2、0.32±0.04、0.68±0.04。分别与对照组、si-NC组比较，si-OIP5-AS1组和si-OIP5-AS1+NC inhibitor组细胞E-cadherin蛋白相对表达水平均显著增加，N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平均显著降低(均P<0.05);与si-OIP5-AS1+NC inhibitor组比较，si-OIP5-AS1+ miR-129 inhibitor组细胞E-cadherin蛋白相对表达水平显著下降，N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05)。

4 过表达KRAS减弱miR-129 mimic对食管癌细胞增殖、EMT的影响

NC mimic组转染NC mimic,miR-129 mimic组转染miR-129 mimic,miR-129 mimic+Vector组转染miR-129 mimic和Vector,miR-129 mimic+KRAS组转染miR-129 mimic和KRAS。

结果见图1和表3。与NC mimic组比较，miR-129 mimic组和miR-129 mimic+Vector组细胞

图1 各组细胞KRAS及上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达情况

表3 各组TE-1细胞增殖及KRAS蛋白表达水平的比较

72 h OD值及KRAS、N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平均显著降低，E-cadherin蛋白相对表达水平显著升高(均P<0.05);与miR-129 mimic+Vector组比较，miR-129 mimic+KRAS组细胞24、48、72 h OD值及KRAS、N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平均显著升高，E-cadherin蛋白相对表达水平显著减少(均P<0.05)。

三、讨论

本研究结果发现，与正常细胞比较，ESCC细胞中OIP5-AS1和KRAS均显著高表达，而miR-129表达下调，同时在线预测网站及双荧光素酶报告基因实验结果显示，OIP5-AS1与miR-129、KRAS与miR-129靶向结合。这提示OIP5-AS1可能通过miR-129调控KRAS癌基因在ESCC中发挥重要作用。CCK-8实验结果发现，抑制OIP5-AS1的表达，或过表达miR-129后，TE-1细胞的增殖活性均显著受到抑制，TE-1细胞凋亡率均明显提高，这提示高表达OIP5-AS1或低表达miR-129均可诱导TE-1细胞增殖，抑制凋亡，加速ESCC的进展。同时，本研究结果还发现，敲低miR-129表达后可明显上调OIP5-AS1的表达，并削弱了低表达OIP5-AS1对TE-1细胞增殖的抑制作用，减弱OIP5-AS1对TE-1细胞凋亡的促进作用；此外，本研究结果还发现，过表达miR-129后，KRAS蛋白表达明显受到抑制，且KRAS的上调可显著削弱miR-129 mimic对TE-1细胞增殖的抑制作用， 这些结果均提示OIP5-AS1可通过miR-129靶向调节KRAS参与ESCC的进展。

本研究中观察到，抑制OIP5-AS1的表达或过表达miR-129均可显著上调E-cadherin蛋白表达，并下调N-cadherin、Vimentin蛋白表达；且过表达miR-129可逆转OIP5-AS1对E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达的调控作用；此外，本研究还观察到，上调KRAS可明显削弱过表达miR-129对E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达的调控作用；这提示OIP5-AS1可通过调节miR-129靶向KRAS促进ESCC细胞发生EMT,并加重ESCC病情。

参考文献:

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基金资助:福建省教育厅中青年教师教育科研基金资助项目(JAT200531);

文章来源:许俊凯,刘剑雄,陈奇松,等.LncRNA OIP5-AS1对食管鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(11):1573-1577.