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摘要:目的 探讨LncRNA OIP5-AS1对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法 将TE-1细胞随机分为对照组(正常培养)、si-NC组(转染si-NC)、si-OIP5-AS1组(转染si-OIP5-AS1)、si-OIP5-AS1+NC inhibitor组(转染si-OIP5-AS1、NC inhibitor)、si-OIP5-AS1+miR-129 inhibitor组(转染si-OIP5-AS1、miR-129 inhibitor)、NC mimic组(转染NC mimic)、miR-129 mimic组(转染miR-129 mimic)、miR-129 mimic+Vector组(转染miR-129 mimic、Vector)、miR-129 mimic+KRAS组[转染miR-129 mimic、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)]。用实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞中OIP5-AS1、miR-129的表达水平,用蛋白质印迹实验检测细胞中KRAS、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白的表达水平,用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞的增殖情况,用原位末端标记(TUNEL)实验检测各组细胞的凋亡情况。结果 对照组、si-NC组、si-OIP5-AS1组、si-OIP5-AS1+NC inhibitor组和si-OIP5-AS1+miR-129 inhibitor组细胞OIP5-AS1表达量分别为1.00±0.13、0.98±0.12、0.25±0.04、0.25±0.02和0.89±0.08,miR-129表达量分别为1.00±0.15、0.97±0.07、2.06±0.17、2.04±0.11和1.22±0.15,72 h光密度(OD)分别为1.16±0.12、1.11±0.09、0.58±0.03、0.58±0.05和0.94±0.10。NC mimic、miR-129 mimic、miR-129 mimic+Vector、miR-129 mimic+KRAS组的KRAS蛋白相对表达水平分别为1.08±0.07、0.41±0.06、0.40±0.06和1.03±0.10,72 h OD值分别为1.17±0.10、0.59±0.03、0.60±0.04和0.90±0.05。si-NC组的上述指标与si-OIP5-AS1组比较,si-OIP5-AS1+NC inhibitor组的上述指标与si-OIP5-AS1+miR-129 inhibitor组比较,NC mimic组的上述指标与miR-129 mimic组比较,miR-129 mimic+Vector组的上述指标与miR-129 mimic+KRAS组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 OIP5-AS1可通过调节miR-129靶向KRAS,促进ESCC细胞增殖和上皮间质转化。
食管癌(esophagus cancer)是一种复杂的疾病,食管癌主要有2种组织学类型,即食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌,中国ESCC患者占所有食管癌患者的90%[1]。长链非编码RNA (long non-coding, lncRNA)被认为是一类新的转录本,其长度为200个核苷酸,lncRNAs与ESCC的发生进展和转移密切相关[2]。研究表明,lncRNA OIP5-AS1的高表达可促进食管癌的放射抵抗[3]。研究证实,LncRNAs可作为miRNA的竞争内源性RNA,参与微小RNA(micro RNA, miRNAs)对下游靶基因的靶向调控作用[4]。本研究通过体外实验探究OIP5-AS1对ESCC细胞恶性生物学行为的影响,并探讨其下游分子机制。
一、材料与方法
1 材料
细胞人食管癌细胞Eca109、EC9706、TE-1及人正常食管上皮细胞HET-1A,均购自美国ATCC公司。
试剂RPMI-1640培养基,上海爱必信生物科技公司生产;Lipofectamine 3000 转染试剂,北京兴怡雅创生物技术有限公司生产;Trizol试剂,上海晶抗生物工程有限公司生产;反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)试剂盒,均为上海烜雅生物科技有限公司生产;Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma virus oncogene, KRAS)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)一抗试剂,均为英国Abcam公司产品;双荧光酶报告基因检测试剂盒,上海烜雅生物科技有限公司生产;细胞计数试剂盒-8(cell coun-ting kit, CCK-8),南京沃博生物科技有限公司生产;原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl trans-ferase mediated nick end labeling, TUNEL)凋亡检测试剂盒,武汉科斯坦生物科技有限公司生产。引物及质粒,均由上海碧云天生物技术公司提供。
仪器FlexA-200全波长酶标仪,杭州奥盛仪器有限公司产品;PikoReal RT-qPCR仪,美国赛默飞世尔科技有限公司产品;MF53-N荧光显微镜,广州市明美光电技术有限公司产品。
2 实验方法
2.1 细胞培养[5]5]
人食管癌细胞系(Eca109、EC9706、TE-1)和正常的HET-1A食管上皮细胞系均在含有添加10%胎牛血清及1%双抗(青-链霉素)的RPMI-1640培养基中并将培养基置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养,每隔1 d更换培养液。
2.2 细胞转染[6]6]与细胞分组
将TE-1按照每孔5×104个细胞的标准接种于6孔板中,根据实验要求将RE-1细胞随机分为对照组、si-NC组、si-OIP5-AS1组、si-OIP5-AS1+NC inhibitor组、si-OIP5-AS1+miR-129 inhibitor组、NC mimic组、miR-129 mimic组、miR-129 mimic+Vector组、miR-129 mimic+KRAS组。对照组细胞为正常培养的细胞,si-NC组、si-OIP5-AS1组、NC mimic组、miR-129 mimic组细胞待细胞融合至65%左右时用Lipofectamine 3000转染试剂分别将si-NC、si-OIP5-AS1、NC mimic、miR-129 mimic转染至细胞;si-OIP5-AS1+NC inhibitor组细胞用转染试剂将si-OIP5-AS1、NC inhibitor共转染至细胞;si-OIP5-AS1+miR-129 inhibitor组细胞将si-OIP5-AS1、miR-129 inhibitor共转染至细胞;miR-129 mimic+Vector组细胞将miR-129 mimic、Vector共转染至细胞;miR-129 mimic+KRAS组细胞分别将miR-129 mimic、KRAS转染至细胞,转染48 h后检测转染效率并检测相关指标。
2.3 RT-qPCR实验检测HET-1A、Eca109、EC9706、TE-1细胞中相关基因的表达水平[6]6]
取HET-1A、Eca109、EC9706细胞及分组处理后的TE-1细胞,提取各细胞中总RNA(Trizol法),然后用反转录试剂盒将RNA转录为模板DNA(cDNA),然后进行RT-qPCR扩增,并以U6和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase, GAPDH)为内参,以2-ΔΔCt法进行计算各细胞中相关基因相对表达量。
2.4 蛋白质印迹实验检测细胞中KRAS、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达水平[7]7]
收集HET-1A、Eca109、EC9706细胞及分组处理后的TE-1细胞,用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)冲洗后加入放射免疫沉淀分析裂解液裂解细胞,离心(1.2×104 r·min-1,15 min)后取上清液,用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并转至聚偏二氟乙烯膜,用5%脱脂奶粉封闭膜,1 h后分别加入一抗稀释液(稀释比均为1∶1 000),4 ℃孵育过夜后用二抗稀释液(1∶3 000)进行孵育1 h(37 ℃),然后进行增强化学发光试剂显影后采集图像并分析灰度值。
2.5 CCK-8实验检测细胞的增殖情况[8]8]
取对数期生长的各组TE-1细胞,然后胰酶消化后接种在96孔板中(每孔接种3 000个细胞),培养贴壁后按照上述分组进行转染,并设置空白对照组,然后分别在培养24、48、72 h后每孔加入CCK-8试剂10 μL,在室温下避光培养2 h后用酶标仪检测450 nm波长下的光密度(optical density, OD)值。
2.6 TUNEL实验检测各组细胞的凋亡情况
取各组细胞,胰酶消化后收集细胞沉淀,用PBS重悬后调整细胞密度并制备细胞爬片,参照文献[9]的方法进行操作,用荧光显微镜观察,并计算TUNEL阳性细胞率。
3 统计学处理
用SPSS 25.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用
表示,多组间比较用one-way ANOVA分析,2组间比较用LSD-t检验。
二、结果
1 食管癌细胞中OIP5-AS1、miR-129、KRAS表达情况
与HET-1A细胞比较,Eca109、EC9706、TE-1细胞中OIP5-AS1、KRAS表达水平均显著上调,miR-129表达水平均显著下降(均P<0.05);且在TE-1细胞中OIP5-AS1、KRAS上调水平最高,miR-129下调水平最低,因此后续实验选择TE-1细胞作为后续研究细胞。结果见表1。
2 敲低miR-129减弱si-OIP5-AS1对食管癌细胞增殖的影响
表1 各组细胞中OIP5-AS1、miR-129、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)表达的比较
表2 各组TE-1细胞增殖、凋亡及miR-129、OIP5-AS1表达的比较
对照组细胞为正常培养的细胞;si-NC组、si-OIP5-AS1组分别将si-NC、si-OIP5-AS1转染至细胞;si-OIP5-AS1+NC inhibitor组细胞使用转染试剂将si-OIP5-AS1、NC inhibitor质粒共转染至细胞;si-OIP5-AS1+ miR-129 inhibitor组细胞将si-OIP5-AS1、miR-129 inhibitor质粒共转染至细胞。
分别与对照组、si-NC组比较,si-OIP5-AS1组和si-OIP5-AS1+NC inhibitor组细胞24、48和72 h的OD值及OIP5-AS1表达水平均显著降低,而TUNEL阳性细胞率及miR-129表达水平均显著升高(均P<0.05);与si-OIP5-AS1+NC inhibitor组比较,si-OIP5-AS1+ miR-129 inhibitor组细胞24、48和72 h的OD值及OIP5-AS1表达水平均显著增加,而TUNEL阳性细胞率及miR-129表达水平均显著降低(均P<0.05),见表2。
3 敲低miR-129减弱si-OIP5-AS1对食管癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关蛋白表达的影响
对照组、si-NC组、si-OIP5-AS1组、si-OIP5-AS1+NC inhibitor组、si-OIP5-AS1+ miR-129 inhibitor组的E-cadherin蛋白相对表达水平分别为0.15±0.01、0.16±0.02、0.60±0.04、0.59±0.09和0.34±0.04,N-cadherin蛋白相对表达水平分别为0.93±0.09、0.97±0.11、0.36±0.04、0.37±0.06和0.80±0.06,Vimentin蛋白相对表达水平分别为0.91±0.06、0.89±0.12、0.28±0.2、0.32±0.04、0.68±0.04。分别与对照组、si-NC组比较,si-OIP5-AS1组和si-OIP5-AS1+NC inhibitor组细胞E-cadherin蛋白相对表达水平均显著增加,N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平均显著降低(均P<0.05);与si-OIP5-AS1+NC inhibitor组比较,si-OIP5-AS1+ miR-129 inhibitor组细胞E-cadherin蛋白相对表达水平显著下降,N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05)。
4 过表达KRAS减弱miR-129 mimic对食管癌细胞增殖、EMT的影响
NC mimic组转染NC mimic,miR-129 mimic组转染miR-129 mimic,miR-129 mimic+Vector组转染miR-129 mimic和Vector,miR-129 mimic+KRAS组转染miR-129 mimic和KRAS。
结果见图1和表3。与NC mimic组比较,miR-129 mimic组和miR-129 mimic+Vector组细胞
图1 各组细胞KRAS及上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达情况
表3 各组TE-1细胞增殖及KRAS蛋白表达水平的比较
72 h OD值及KRAS、N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平均显著降低,E-cadherin蛋白相对表达水平显著升高(均P<0.05);与miR-129 mimic+Vector组比较,miR-129 mimic+KRAS组细胞24、48、72 h OD值及KRAS、N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平均显著升高,E-cadherin蛋白相对表达水平显著减少(均P<0.05)。
三、讨论
本研究结果发现,与正常细胞比较,ESCC细胞中OIP5-AS1和KRAS均显著高表达,而miR-129表达下调,同时在线预测网站及双荧光素酶报告基因实验结果显示,OIP5-AS1与miR-129、KRAS与miR-129靶向结合。这提示OIP5-AS1可能通过miR-129调控KRAS癌基因在ESCC中发挥重要作用。CCK-8实验结果发现,抑制OIP5-AS1的表达,或过表达miR-129后,TE-1细胞的增殖活性均显著受到抑制,TE-1细胞凋亡率均明显提高,这提示高表达OIP5-AS1或低表达miR-129均可诱导TE-1细胞增殖,抑制凋亡,加速ESCC的进展。同时,本研究结果还发现,敲低miR-129表达后可明显上调OIP5-AS1的表达,并削弱了低表达OIP5-AS1对TE-1细胞增殖的抑制作用,减弱OIP5-AS1对TE-1细胞凋亡的促进作用;此外,本研究结果还发现,过表达miR-129后,KRAS蛋白表达明显受到抑制,且KRAS的上调可显著削弱miR-129 mimic对TE-1细胞增殖的抑制作用, 这些结果均提示OIP5-AS1可通过miR-129靶向调节KRAS参与ESCC的进展。
本研究中观察到,抑制OIP5-AS1的表达或过表达miR-129均可显著上调E-cadherin蛋白表达,并下调N-cadherin、Vimentin蛋白表达;且过表达miR-129可逆转OIP5-AS1对E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达的调控作用;此外,本研究还观察到,上调KRAS可明显削弱过表达miR-129对E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达的调控作用;这提示OIP5-AS1可通过调节miR-129靶向KRAS促进ESCC细胞发生EMT,并加重ESCC病情。
参考文献:
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基金资助:福建省教育厅中青年教师教育科研基金资助项目(JAT200531);
文章来源:许俊凯,刘剑雄,陈奇松,等.LncRNA OIP5-AS1对食管鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(11):1573-1577.
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