结肠癌老年化趋势显著，上海一项调查显示2003～2005年结直肠癌高发年龄比1973～1977年推迟约10岁，其中结肠癌比直肠癌晚约2岁[1]。老年人体质弱，对外科综合治疗耐受差，副作用明显，生存率低，生存质量差。针对这种情况，多种复方制剂、药物提取物、药物单体被用于治疗结肠癌[2]。在我国桦褐孔菌(IO)是老年人喜欢应用的“保健药物”之一，桦褐孔菌是一种药用真菌，具有消炎、抗肿瘤等多种功效[3],但其作用机制尚未完全明确，疗效无法保证，副作用不明，因此需要明确药物作用机制，引导药物正确使用。肿瘤比正常组织对铁离子更为敏感，细胞内铁离子过少抑制细胞的生长，铁代谢受阻，影响细胞生长[4];同时，铁离子过多也会影响细胞生长，甚至发生细胞死亡，2012年与铁离子关系密切的“铁死亡”被Dixon提出[5]。铁离子转运蛋白中膜铁转运蛋白(FPN)1是唯一将铁离子向细胞外转运的跨膜蛋白，二价金属转运蛋白(DMT)1将进入细胞内的Fe3+转为Fe2+,内吞小体膜上的DMT1将Fe2+转移入胞质[6,7]。癌细胞表现出铁获取和保留增强的趋势，对Fe2+依赖性强[8]。当FPN1降低，DMT1增高，Fe2+在结肠癌细胞内明显增多，细胞代谢活跃，肿瘤增殖，但引发铁死亡的铁堆积也以此为基础。本研究基于Fe2+、FPN1、DMT1探讨IO醇提物抗结肠癌的作用机制。

1、材料与方法

1.1细胞及质粒

选取人源性结肠癌细胞株ht29、hct116、cw-2及正常结肠细胞株ncm460,购于武汉普诺赛生命科技细胞库。质粒来自Addgene公司。

1.2组织芯片

常见多器官癌组织芯片，购于上海芯超生物科技有限公司。

1.3药物、试剂与仪器

IO(桦树茸馆方店),IO醇提物(自提取，深棕色，出膏率5%,0.002、0.004、0.008 mg/ml),5-氟尿嘧啶(Fu, 250 mg/10 ml,海南中化联合制药工业股份有限公司，0.5 mg/ml),CCK-8试剂盒(弗德生物),FPN1(63 kD)、DMT1(62 kD)抗体试剂盒(Abclonal),山羊抗兔IgG荧光二抗FD0133(普诺赛生命科技),活性氧(ROS)、铁调素(Hepcidin)的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(碧云天),Fe2+比色法测试盒(Elabscience)。低温高速离心机(大龙兴创实验仪器有限公司),荧光化学发光成像系统(上海勤翔仪器),酶标仪(Spectramax i3 Molecular devices),聚合酶链反应(PCR)仪(ABI PCR 7500),VE186转膜仪(上海天能科技有限公司),微型垂直电泳槽VE 180(上海天能科技有限公司)。

1.4分组及给药

未转染的结肠癌细胞实验分组为阴性对照组[加入二甲基亚砜(DMSO)及培养液]、阳性对照组(5-Fu 0.5 mg/ml)组、0.002、0.004、0.008 mg/ml组(IO醇提物，DMSO预溶，培养液稀释)。转染后按照细胞转染及用药情况，分为空白组、FPN1过表达组、FPN1沉默组、空白+药物组、FPN1过表达+药物组、FPN1沉默+药物组，比较各组变化情况。当细胞培养满80%以上时给药，给药后继续培养24 h检测各项指标。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖

96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔),弃上清，37℃,5% CO2培养箱培养24 h;每孔加入10μl CCK-8溶液孵育4 h,酶标仪450 nm检测。细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100。

1.6比色法检测Fe2+浓度

根据说明书配制好空白管、标准管、测定管溶液后，在各管加入显色剂，沸水浴5 min,冷却，离心，取上清，520 nm酶标仪测定各管吸光度。计算公式为，Fe2+含量(mg/L)=ΔA1/ΔA2×c1×f(c1=2 mg/L,f:样本稀释倍数。)

1.7生物信息挖掘数据库

通过数据库癌基因组图谱(TCGA,https: //portal.gdc.cancer.gov/)查找结肠癌样本信息，肿瘤亚群基因表达及生存分析平均(UALCAN)数据库(http: //ualcan.path.uab.edu/index.html)分析目标基因在结肠癌和正常结肠组织的差异表达情况，并获得差异表达表。基于临床蛋白质组学肿瘤分析协会(CPTAC)数据库(https: //cptac-data-portal.georgetown.edu/)进行蛋白差异的表达分析。

1.8质粒转染

6孔板接种，加入质粒DNA混合，无血清细胞培养基稀释LipofectamineTM2000,混合转染试剂和质粒DNA稀释液；DNA/脂质体混合物加入各孔，吸去DNA/脂质体混合物加培养基后培养，显微镜下观察见绿色荧光，收集细胞。

1.9免疫组化法及免疫荧光法

免疫组化法：切片脱蜡，微波法抗原修复，血清封闭，加入第一抗体，44℃冰箱过夜，清洗，加入第二抗体，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，封片。

免疫荧光法：10×104个/孔6孔板接种，4%多聚甲醛处理，0.5% Txiton X-100处理，3% H2O2,加FPN1抗体4℃冰箱过夜，滴加荧光二抗2 h,避光下，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5 min,各步均需漂洗，抗荧光淬灭封片剂封片。

1.10 ELISA检测结肠癌细胞ROS、Hepcidin含量

10×104个/孔6孔板接种细胞，培养24 h,给药后再培养24 h,刮取细胞，上清液和细胞分别留存，提取细胞蛋白成分，将各次上清液混合；设置标准品孔和样本孔，每孔加入辣根过氧化物酶标记的抗体100μl, 37℃60 min;清洗，每孔加入底物50μl, 37℃避光孵育15 min,加终止液50μl, 15 min在450 nm波长测定各孔的光密度(OD)值。计算方法为以标准品浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，带入样品OD值，计算出样品浓度。

1.11实时荧光(RT)-PCR检测结肠癌细胞FPN1、DMT1mRNA表达

据美国国家生物技术信息中心基因数据库(NCBI Genebank)上的基因序列设计一对引物，扩增的片段长度为100～300 bp。大连宝生物RT-PCR试剂盒(DRR037)采集组织样用于提取总RNA,于酶标仪280 nm处进行检测吸光度。两步法PCR扩增标准程序：预变性95℃30 s; 95℃5 s, 60℃34 s 40个循环。PCR仪检测。引物序列(5′-3′)为：FPN1正向：ACCAACATCTTAGCCCCCAT,反向：ACCTTCCAGAGCAGGACGTAC;DMT1正向：GTTTTCTTATGAGCATTGCCTACC,反向：CCTTGGGATACTGACGGTGAC。

1.12 Western印迹检测结肠癌细胞FPN1、DMT1蛋白表达

不同组细胞经处理后用裂解液裂解，提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定总蛋白浓度。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)跑出分离胶分离蛋白，聚偏氟乙烯(PVDF)膜转膜，TBST缓冲液洗涤2次，5%脱脂牛奶封闭，一抗(1∶500)4℃冰箱过夜，滴加二抗室温下孵育1 h免疫杂交。显影液均匀滴注于PVDF膜上1 min拍照。

1.13统计学分析

采用SPSS19.0软件进行F检验、t检验等。

2、结 果

2.1 IO醇提物干预后细胞变化

0.004 mg/ml组与阴性对照组、0.002 mg/ml组比较，细胞活力明显降低，但明显高于0.008 mg/ml组(P<0.05),与阳性对照组比较差异性不显著(P>0.05)。观察0.008 mg/ml组可见细胞碎片多，完整细胞少，有视野见细胞荒芜状态，残存细胞皱缩明显，失去正常形态，考虑此浓度毒性较大。IO醇提物加入结肠癌细胞后细胞上清Fe2+浓度发生改变，0.002 mg/ml组Fe2+浓度明显低于阴性对照组(P<0.05);0.004 mg/ml组与阴性对照组、0.002 mg/ml组比较，Fe2+浓度明显下降(P<0.05),与阳性对照组比较差异不显著(P>0.05),0.008 mg/ml组因细胞大量死亡，破碎，细胞内物质进入上清，导致其与阴性对照组比较差异性不显著(P>0.05)。考虑IO醇提物药效、副作用及细胞敏感性，后续实验选用0.004 mg/ml IO醇提物，选取ht29结肠癌细胞。见表1、图1。

表1 IO醇提物对结肠癌细胞活力及上清Fe2+变化的影响

图1 0.8 ml/ml IO醇提物干预后细胞发生的变化(×40)   

2.2 FPN1和DMT1在结肠癌和正常组织中表达的生物信息学

TCGA数据库查询、UALCAN数据库分析获得FPN1、DMT1 mRNA的差异分析结果显示，FPN1 mRNA在结肠癌细胞中表达明显下调，DMT1 mRNA在结肠癌细胞中表达明显上调(P<0.05)。基于CPTAC数据库分析二者蛋白差异，结果未查询到FPN1的有效数据，只见DMT1蛋白在结肠癌细胞中差异表达明显上调(P<0.05)。见表2。

2.3结肠癌细胞中FPN1和DMT1蛋白表达

与正常结肠细胞株ncm460比较，结肠癌细胞ht29、hct116、cw-2中FPN1蛋白表达明显降低，DMT1蛋白表达明显升高(P<0.05)。见图2、图3、表3。

表2 TCGA、UALCAN数据库分析FPN1、DMT1 mRNA表达及CPTAC数据库分析DMT1蛋白表达

图2正常结肠组织与结肠癌组织中FPN1和DMT1表达(免疫组化染色，×20)   

图3各组FPN1和DMT1蛋白表达 

表3正常结肠细胞与结肠癌细胞中FPN1和DMT1蛋白表达

2.4 IO醇提物干预后FPN1和DMT1mRNA及蛋白表达

与阴性对照组比较，IO醇提物不同浓度组FPN1 mRNA及蛋白表达明显下降，具有一定浓度依赖性；除0.008 mg/ml组DMT1 mRNA有统计学差异(均P<0.05)外，其余组DMT1 mRNA及IO醇提物不同浓度组DMT1蛋白表达无显著差异(P>0.05),推测IO醇提物作用点在FPN1。见图3、表4。

表4不同浓度IO醇提物对FPN1和DMT1 mRNA及蛋白表达的影响

2.5 FPN1转染后ht29结肠癌细胞情况

FPN1转染后，与空白组比较，各组细胞活力明显下降(P<0.05),FPN1过表达组与FPN1过表达+药物组比较细胞活力差异不显著(P>0.05),FPN1沉默组与FPN1沉默+药物组细胞活力差异显著(P<0.05)。与FPN1过表达组和FPN1沉默组比较，两组对应的加药组FPN1表达显著下降(P<0.05)。荧光染色情况显示，IO醇提物干预后结肠癌细胞FPN1表达呈降低趋势，加药组与其对应未加药组相比荧光亮度和范围明显减小。空白+药物组、FPN1沉默+药物组与其对应的未加药组相比，Hepcidin水平明显增加(P<0.05);FPN1过表达+药物组与FPN1过表达组无显著差异(P>0.05)。与空白组比较，仅过表达+药物组ROS水平无显著性差异(P>0.05),FPN1沉默+药物组、FPN1过表达+药物组与其对应的未加药组ROS水平比较有统计学差异(P<0.05)。见图4、表5、图5。

图4 IO醇提物对转染后结肠癌细胞中FPN1蛋白表达的影响  

表5 IO醇提物对转染后结肠癌细胞增殖、细胞中FPN1蛋白表达及Hepcidin、ROS水平的影响

图5各组转染后结肠癌细胞(免疫荧光，×20)  

3、讨 论

与正常细胞相比，肿瘤细胞对铁的依赖性更强，临床资料显示，对比健康人与癌症患者机体铁含量发现，癌症患者的铁含量流失明显多于健康同龄人，这种现象被称为铁成瘾[9]。饮食铁摄入量和结直肠癌发病率之间的关系已经有学者评估，Cross等[10]对前瞻性研究显示，结肠癌和红肉摄入量之间存在正相关关系，血红素铁的增加可能是肉类摄入与结肠癌之间关联的一个因素。可见，铁对于结肠癌的发生发展具有独特意义，本研究发现，IO醇提物可降低结肠癌细胞增殖能力及上清中铁离子浓度，干扰细胞FPN1等铁离子转运蛋白。

FPN1蛋白是可溶性载体家族成员之一，早期FPN1蛋白的研究多局限于铁代谢，而铁离子的作用也侧重于细胞生长发育这一方面，铁离子浓度降低可引发细胞死亡；但是铁死亡概念的提出指出铁过载的情况下，细胞死亡也增加，当细胞内Fe2+超过细胞所需浓度时，即发生不良后果，这对于铁依赖的肿瘤组织更为重要。通过下调FPN1诱导精原细胞铁死亡[11]。低氧可降低HTR-8/SVneo细胞的侵袭力，诱导铁死亡，表现为Fe2+升高和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)4和FPN1表达下调[12]。铁摄取增加或铁输出减少都会增加肿瘤细胞对氧化损伤和铁死亡的敏感性[13],当FPN1降低引起Fe2+大量蓄积于细胞内时就会引发细胞死亡，本研究中IO醇提物对于Fe2+的影响就可能因为IO醇提物使FPN1表达降低引起，也可能由此激发细胞铁死亡途径。本研究显示，当FPN1过表达时，大量Fe2+转运出细胞，细胞正常代谢受到干扰，影响细胞增殖能力，细胞活力下降；当FPN1沉默时，FPN1蛋白表达下降，此时细胞内Fe2+堆积，铁过载使ROS增多，可使细胞死亡，可能为铁死亡，同样出现细胞增殖能力下降。同理，空白+药物组和FPN1沉默+药物组中IO醇提物使FPN1蛋白表达下降，引起铁过载，出现相似反应。FPN1过表达+药物组虽然也同样引起FPN1蛋白表达下降，但由于是在FPN1过表达的情况下发挥作用，因此在一定程度上恢复了FPN1蛋白的正常浓度，细胞内Fe2+浓度因此恢复，细胞活力有所恢复。从此种情况可以看出，IO醇提物对FPN1有一定的靶向性，特别是肿瘤细胞普遍的铁依赖情况，使这一药物的靶向研究具有意义。

Hepcidin是FPN1的调节蛋白，它可结合细胞膜上的FPN1,介导内化降解FPN1,调控铁代谢，维持铁稳态[14]。IO醇提物增加Hepcidin表达可间接降低FPN1蛋白浓度，推测这是IO醇提物降低FPN1的作用机制之一。本研究中Hepcidin在FPN1过表达加药后增加不显著，因为IO醇提物杀死肿瘤细胞，减少肿瘤细胞自分泌和旁分泌产生[15]的Hepcidin,使IO醇提物增加Hepcidin的作用弱化；同时FPN1过表达反馈抑制Hepcidin表达，二者作用叠加导致Hepcidin在FPN1过表达+药物组增加不显著。脂质ROS的过量积累是铁死亡的核心，铁死亡时胞内ROS不断累积，引发细胞死亡[16]。如氟哌啶醇可显著增加细胞中Fe2+含量，提高ROS水平，对肝癌细胞杀伤能力增强[17];桦木树皮甲醇提取物会使结直肠癌细胞内ROS过量累积，导致细胞活性下降至死亡[18]。本研究说明，IO醇提物可增加ROS含量，IO醇提物可不依赖于FPN1提升细胞内ROS含量，且可以扭转FPN1蛋白引起的ROS降低，使其趋于空白组ROS含量，推测是通过FPN1对Fe2+的调节影响ROS含量。

综上，IO醇提物可通过FPN1调节结肠癌细胞Fe2+对ROS产生影响，促进结肠癌细胞死亡；此为IO醇提物提高ROS含量的途径之一，也提示IO醇提物抗结肠癌机制可能与铁死亡途径相关。铁依赖使肿瘤细胞比健康细胞更容易受到铁超载和ROS积累的影响，这使铁离子相关蛋白的靶向治疗成为可能。

参考文献:

[1]田传鑫,赵磊.结直肠癌及结直肠癌肝转移流行病学特点[J].中华肿瘤防治杂志,2021;28(13):1033-8.

[2]白姣姣,阿丽亚·依拉木,阿布都艾则孜·艾尔肯,等.中药复方及单体治疗结肠癌药效与机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2023;29(4):246-52.

[3]崔贺铭,张玉莹,高洋,等.桦褐孔菌主要活性成分及药理作用研究进展[J].长春中医药大学学报,2022;38(2):221-5.

[6]张立加,蔡静明,沈洁,等.铁超载对NAFLD大鼠DMT1和FPN1基因表达影响[J].中国公共卫生,2018;34(5):716-9.

[9]马磊.FPN1下调通过激活p-AKT､p-STAT3通路促进肝癌细胞恶性进展[D].广州:广东药科大学,2018.

基金资助:辽宁省教育厅科学研究基金(2100221011);辽宁中医药大学高层次引进人才科研启动基金(2100221006);

文章来源:王蔚,陈文娜,王奡,等.基于FPN1探讨桦褐孔菌醇提物抗结肠癌的作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(13):3224-3229.