宫颈癌是发展中国家妇女癌症相关死亡的主要原因，晚期宫颈癌患者常因远处转移而死亡[1]。顺铂是广泛用于宫颈癌的化疗药物，而部分患者会对顺铂耐药，从而导致化疗失败、肿瘤复发和预后不良[2]。因此，增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性将有助于改善宫颈癌患者的治疗结局。

藁本内酯是当归、川芎挥发油的主要成分，具有抗炎、抗肿瘤等多种药理活性[3]。研究表明，藁本内酯具有抗肿瘤作用，可恢复肺癌细胞对顺铂的敏感性，为中药治疗顺铂耐药肺癌提供了可能[4]。Hippo信号通路可通过促进细胞凋亡和抑制细胞增殖来控制组织生长，其表达异常会导致组织过度增殖[5]。Yes相关蛋白（Yesassociated protein,YAP）/具有PDZ结合基序的转录共激活因子（transcriptional coactivator with PDZ binding mo‐tif,TAZ）是Hippo信号通路级联的下游效应因子，其异常激活可引起肿瘤细胞的过度增殖[6]，因此Hippo-YAP信号通路在肿瘤领域备受学者关注，其抑制剂有望成为肿瘤治疗的候选药物之一[7]。研究表明，YAP在控制宫颈癌进展中具有核心作用，其低表达与宫颈癌患者预后不良有关[8]，提示靶向Hippo-YAP信号通路可调控宫颈癌的发展。此外有实验证实，Hippo-YAP信号通路与肿瘤耐药有关，抑制该通路可提高卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性[9]。基于以上证据，本研究以宫颈癌顺铂耐药细胞He La/DDP为对象，从Hippo-YAP信号通路出发，初步探究藁本内酯对宫颈癌耐药细胞的影响及潜在机制，以期为宫颈癌新型治疗药物的研发提供参考。

1、材料

1.1主要仪器

本研究所用主要仪器包括Spectra Max®Paradigm型酶标仪（美国Molecular Devices公司），Attune Cyt Pix型流式细胞仪、E-Gel Imager型凝胶成像系统（美国Thermo Fisher Scientific公司），BX53M型显微镜（日本Olympus公司）等。

1.2主要药品与试剂

藁本内酯原料药（批号HY-N0401A，纯度99.17%）、顺铂对照品（批号HY-17394，纯度99.84%）、ECL试剂（批号HY-K1005）均购自美国Med Chem Express公司；DMEM培养基（批号BC-M-030）购自南京森贝伽生物科技有限公司；Trizol试剂（批号B511311-0100）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；CCK-8试剂盒（批号CK04）购自日本Dojido公司；AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（批号40302ES60）、RIPA裂解液（批号20101ES60）均购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；兔源YAP、TAZ、基质金属蛋白酶2(matrix metallopro‐teinase 2,MMP2）、切割型胱天蛋白酶3(cleaved-caspase-3）、caspase-3、β-肌动蛋白（β-actin）抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批号分别为4912S、83669S、4022S、9661S、9662S、4967S、7074S）均购自美国CST公司；重组兔增殖细胞相关抗原Ki67抗体（批号为ab16667）购自英国Abcam公司。

1.3细胞

人宫颈癌顺铂耐药细胞He La/DDP（批号CL0677）购自湖南丰晖生物科技有限公司。

2、方法

2.1细胞培养

取He La/DDP细胞，接种于含1%青-链霉素双抗和10%胎牛血清的DMEM培养基（以下称“完全培养基”）中，于37℃、5%CO2条件下培养。

2.2 He La/DDP细胞增殖情况检测

采用CCK-8法检测。取对数生长期的He La/DDP细胞，接种于96孔板中，常规培养过夜后，将细胞分为对照组、顺铂组（10μmol/L顺铂[10]）和顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组（10μmol/L顺铂+25、50、100μmol/L藁本内酯，藁本内酯的剂量参考文献[11]和前期预实验结果设置），每组设置6个复孔。对照组细胞加入完全培养基，其余各组加入含相应药液的完全培养基。培养24 h，每孔加入CCK-8试剂10μL，孵育2 h后，使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值，并计算增殖抑制率[增殖抑制率=（1-实验组OD值）/对照组OD值×100%]。

2.3 He La/DDP细胞凋亡情况检测

采用流式细胞术检测。取对数生长期的He La/DDP细胞，接种于96孔板中，按“2.2”项下方法分组、干预。培养24 h，收集细胞，经磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗后重悬；取上述细胞悬液100μL，依次加入AnnexinⅤ-FITC染液和PI染液各5μL，混匀，室温下避光孵育15 min后，使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率（即早期凋亡、晚期凋亡细胞之和与总细胞数的比值）。

2.4 He La/DDP细胞迁移能力检测

采用划痕实验检测。取对数生长期的He La/DDP细胞，经消化后重悬并接种于24孔板中，于各孔底部划线，用PBS清洗后，将细胞按“2.2”项下方法分组、干预。使用显微镜分别在培养0、48 h时记录各组细胞的划痕愈合情况，采用Image J软件分析并计算各组细胞的划痕愈合率[划痕愈合率=（0 h时的划痕面积-24 h时的划痕面积）/0 h时的划痕面积×100%]。

2.5 He La/DDP细胞侵袭能力检测

采用Transwell实验检测。取对数生长期的He La/DDP细胞，经消化后重悬并接种于预先用matrigel胶处理的Transwell小室的上层；取含10%胎牛血清的DMEM培养基，接种于Transwell小室的下层。将上室细胞按“2.2”项下方法分组、干预。培养24 h，收集穿膜细胞，用多聚甲醛固定，再以结晶紫染液染色，冲洗、晾干后，使用显微镜观察侵袭细胞（呈紫色）并计数。

2.6 He La/DDP细胞中YAP、TAZ m RNA表达水平检测

采用定量实时聚合酶链式反应（quantitative realtime PCR,q RT-PCR）法检测。取对数生长期的He La/DDP细胞，接种于96孔板中，按“2.2”项下方法分组、干预。培养24 h，收集细胞，以PBS清洗后加入Trizol试剂提取RNA；将所得RNA反转录为c DNA后进行PCR扩增。PCR反应体系包括正、反向引物各0.4μL,c DNA模板5μL,mix 10μL,dd H2O 4.2μL。PCR反应条件为95℃预变性30 s;95℃变性30 s,60℃退火5 s，循环38次；72℃延伸15 s。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，使用2-ΔΔCt法分析YAP、TAZ m RNA的表达水平，结果以对照组作为参照进行归一化处理。PCR引物序列及产物长度见表1。

表1 PCR引物序列及产物长度  

2.7 He La/DDP细胞中相关蛋白表达水平检测

采用Western blot法检测。取对数生长期的He La/DDP细胞，接种于96孔板中，按“2.2”项下方法分组、干预。培养24 h，收集细胞，用PBS清洗后加入RIPA裂解液提取总蛋白，蛋白经定量后进行变性处理。取变性蛋白适量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至聚偏二氟乙烯膜上，用脱脂奶粉于4℃下封闭过夜；洗膜后，加入YAP、TAZ、MMP2、Ki67、cleavedcaspase-3、caspase-3、β-actin一抗（稀释度均为1︰1 000),4℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释度为1︰5 000），室温下孵育1 h；洗膜后，以ECL试剂显色，再用凝胶成像系统成像。使用Image J软件分析各蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平，并计算cleaved-caspase-3与caspase-3蛋白的表达水平比值（cleaved-caspase-3/caspase-3）。

2.8统计学方法

采用Graph Pad Prism 7.0软件对数据进行统计分析。数据以表示。多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

3、结果

3.1藁本内酯对He La/DDP细胞增殖抑制率的影响

与对照组比较，顺铂组细胞的增殖抑制率显著升高（P<0.05）；与顺铂组比较，顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组细胞的增殖抑制率亦显著升高，且呈浓度依赖性（P<0.05）。结果见图1A。

图1藁本内酯对He La/DDP细胞增殖抑制率、凋亡率的影响（x±s,n=6)   

3.2藁本内酯对He La/DDP细胞凋亡率的影响

与对照组比较，顺铂组细胞的凋亡率显著升高（P<0.05）；与顺铂组比较，顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组细胞的凋亡率亦显著升高，且呈浓度依赖性（P<0.05）。结果见图1B、图2。

3.3藁本内酯对He La/DDP细胞迁移能力的影响

与对照组比较，顺铂组细胞的划痕愈合率显著降低（P<0.05）；与顺铂组比较，顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组细胞的划痕愈合率亦显著降低，且呈剂量依赖性（P<0.05）。结果见图3、图4A。

图2藁本内酯对He La/DDP细胞凋亡影响的流式细胞图 

图3藁本内酯对He La/DDP细胞迁移能力影响的显微图  

图4藁本内酯对He La/DDP细胞迁移、侵袭能力的影响

3.4藁本内酯对He La/DDP细胞侵袭能力的影响

与对照组比较，顺铂组的侵袭细胞数显著减少（P>0.05）；与顺铂组比较，顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组的侵袭细胞数亦显著减少，且呈浓度依赖性（P<0.05）。结果见图4B、图5。

3.5藁本内酯对He La/DDP细胞中YAP、TAZ m RNA表达的影响

与对照组比较，顺铂组细胞中YAP、TAZ m RNA表达水平均显著降低（P<0.05）；与顺铂组比较，顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组细胞中YAP、TAZ m RNA的表达水平亦显著降低，且呈浓度依赖性（P<0.05）。结果见图6。

3.6藁本内酯对He La/DDP细胞相关蛋白表达的影响

与对照组比较，顺铂组细胞中YAP、TAZ、MMP2、Ki67蛋白的表达水平均显著降低，cleaved-caspase-3/cas‐pase-3显著升高（P<0.05）；与顺铂组比较，顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组细胞中YAP、TAZ、MMP2、Ki67蛋白的表达水平均显著降低，cleaved-caspase-3/caspase-3均显著升高，且呈浓度依赖性（P<0.05）。结果见图7。

图5藁本内酯对He La/DDP细胞侵袭能力影响的显微图 

图6藁本内酯对He La/DDP细胞中YAP、TAZ m RNA表达的影响  

图7藁本内酯对He La/DDP细胞中相关蛋白表达的影响

4、讨论

目前，传统化疗是临床治疗多种肿瘤的常规方法，其中顺铂是最早出现且最有效的铂类化疗药物。然而临床实践显示，肿瘤细胞常产生化学耐药性，从而使得化疗的长期疗效受限[12]。在外照射治疗期间每周静脉滴注1次顺铂是临床晚期宫颈癌患者的标准治疗方案[13]。然而，由于顺铂耐药的发生，使得宫颈癌患者的治疗效果不佳[14]，故有必要寻找可降低宫颈癌细胞对顺铂耐药的方法或药物，以改善宫颈癌患者的预后。

藁本内酯是一种具有代表性的苯酞化合物，在当归挥发油中的含量超过50%[3]。研究表明，藁本内酯对多种疾病具有治疗潜力，包括卵巢癌、乳腺癌、糖尿病肾病、骨关节炎等[15]。Yin等[16]研究表明，藁本内酯可剂量依赖性地影响膀胱癌细胞的存活；Qi等[11]研究表明，在他莫昔芬耐药乳腺癌细胞中，藁本内酯可通过抑制自噬使细胞再次获得敏感性。上述研究表明，藁本内酯可减弱膀胱癌和乳腺癌细胞的存活率或耐药性，但该成分能否提高顺铂耐药宫颈癌细胞对顺铂的敏感性尚不清楚。

本研究结果显示，与对照组比较，顺铂单独处理He La/DDP细胞后，细胞的增殖抑制率显著升高，表明He La/DDP细胞对顺铂有一定的敏感性；随后，本研究以顺铂和不同浓度藁本内酯联合干预后，He La/DDP细胞的增殖抑制率进一步呈浓度依赖性升高，与前人研究结果类似[10]，说明藁本内酯可增加He La/DDP细胞对顺铂的敏感性。本研究进一步通过划痕实验和侵袭实验发现，顺铂单独处理He La/DDP细胞后，其迁移和侵袭能力有所改变；随后，本研究以顺铂和不同浓度藁本内酯联合干预He La/DDP细胞，其划痕愈合率、侵袭细胞数进一步呈浓度依赖性降低，说明顺铂和藁本内酯联合可抑制He La/DDP细胞的迁移、侵袭。

MMP2、Ki67、cleaved-caspase-3、caspase-3分别是细胞迁移、侵袭、增殖和凋亡的标志物，抑制MMP2、Ki67表达和增加cleaved-caspase-3/caspase-3有利于增强宫颈癌耐药细胞对顺铂的敏感性[10,17,18]。细胞凋亡实验和Western blot实验结果显示，顺铂和不同浓度藁本内酯联合刺激可使He La/DDP细胞的增殖抑制率和凋亡率呈剂量依赖性升高，MMP2、Ki67蛋白表达显著下调，cleaved-caspase-3/caspase-3显著升高。这提示顺铂和藁本内酯联合能够促进He La/DDP细胞的凋亡，并提高He La/DDP细胞对顺铂的敏感性，有望作为辅助治疗宫颈癌的潜在化疗方案。

不受控制的细胞增殖是肿瘤发生的关键特征，YAP/TAZ是促进恶性肿瘤发展的Hippo信号通路的主要下游效应因子，其异常表达可引起肿瘤细胞的过度增殖，与多种肿瘤的发生、发展及细胞耐药性有关[6,19]。陈鹏等[20]研究发现，阻断YAP信号通路激活后，乳腺癌耐药细胞的耐药指数显著降低，提示该通路可能参与乳腺癌细胞的耐药过程。为探讨藁本内酯提高He La/DDP细胞顺铂敏感性的潜在机制，本研究检测了YAP、TAZ m RNA及蛋白的表达水平，结果显示，顺铂和藁本内酯联合可显著抑制He La/DDP细胞中YAP、TAZ m RNA及蛋白的表达，表明藁本内酯提高顺铂敏感性的作用可能与抑制Hippo-YAP信号通路有关。

综上所述，顺铂联合藁本内酯可减少宫颈癌顺铂耐药细胞He La/DDP的增殖，抑制其迁移、侵袭，并诱导其凋亡，提高耐药细胞对顺铂的敏感性；上述作用可能与Hippo-YAP信号通路被抑制有关。本研究结果尚需在宫颈癌动物模型中进行进一步验证。

参考文献:

[9]黄根华,谭布珍,占伏良,等.基于Hippo/yap/TAZ途径探讨雷公藤内酯醇-聚乙烯亚胺-环糊精逆转卵巢癌耐药的作用及机制[J].中药新药与临床药理,2020,31(2):185-191.

[10]申昌梅,廖振蓉,余瑛.基于PI3K/Akt信号通路探讨槲皮素增强顺铂对人宫颈癌顺铂耐药细胞HeLa/DDP的作用[J].中成药,2022,44(11):3667-3671.

[17]王博,李恩萍,杨长春,等.汉黄芩素通过调节P53信号通路增强宫颈癌对顺铂的化疗敏感性[J].中国免疫学杂志,2020,36(3):325-331.

[18]周婷婷,沈卫星,陈桐庆,等.预知子提取物增敏奥沙利铂诱导结肠癌HCT116细胞凋亡的研究[J].南京中医药大学学报,2022,38(3):204-211.

[20]陈鹏,徐婷,郭丹,等. YAP蛋白在HER2阳性乳腺癌拉帕替尼耐药中的作用[J].第三军医大学学报,2020,42(7):692-698.

基金资助:国家自然科学基金项目(No.82100083);

文章来源:张文渊,王倩,张丽红,等.藁本内酯对宫颈癌细胞化疗耐药性的影响[J].中国药房,2024,35(13):1582-1587.