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摘要:目的 基于Hippo-Yes相关蛋白(YAP)信号通路探讨藁本内酯对宫颈癌细胞化疗耐药性的影响。方法 将人宫颈癌顺铂耐药细胞HeLa/DDP分为对照组、顺铂组(10μmol/L顺铂)和顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组(10μmol/L顺铂+25、50、100μmol/L藁本内酯),检测各组细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭情况,以及YAP、具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)mRNA和YAP、TAZ、基质金属蛋白酶2(MMP2)、Ki67、切割型胱天蛋白酶3(cleaved-caspase-3)、caspase-3蛋白的表达情况。结果 与对照组比较,顺铂组细胞的增殖抑制率、凋亡率和cleaved-caspase-3/caspase-3均显著升高;划痕愈合率、侵袭细胞数,YAP、TAZ mRNA和YAP、TAZ、MMP2、Ki67蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05)。与顺铂组比较,顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组细胞的增殖抑制率、凋亡率和cleaved-caspase-3/caspase-3均进一步升高;划痕愈合率、侵袭细胞数,YAP、TAZ mRNA和YAP、TAZ、MMP2、Ki67蛋白的表达水平均进一步降低,且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论 藁本内酯可通过抑制Hippo-YAP信号通路提高宫颈癌耐药细胞对顺铂的敏感性。
宫颈癌是发展中国家妇女癌症相关死亡的主要原因,晚期宫颈癌患者常因远处转移而死亡[1]。顺铂是广泛用于宫颈癌的化疗药物,而部分患者会对顺铂耐药,从而导致化疗失败、肿瘤复发和预后不良[2]。因此,增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性将有助于改善宫颈癌患者的治疗结局。
藁本内酯是当归、川芎挥发油的主要成分,具有抗炎、抗肿瘤等多种药理活性[3]。研究表明,藁本内酯具有抗肿瘤作用,可恢复肺癌细胞对顺铂的敏感性,为中药治疗顺铂耐药肺癌提供了可能[4]。Hippo信号通路可通过促进细胞凋亡和抑制细胞增殖来控制组织生长,其表达异常会导致组织过度增殖[5]。Yes相关蛋白(Yesassociated protein,YAP)/具有PDZ结合基序的转录共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ binding mo‐tif,TAZ)是Hippo信号通路级联的下游效应因子,其异常激活可引起肿瘤细胞的过度增殖[6],因此Hippo-YAP信号通路在肿瘤领域备受学者关注,其抑制剂有望成为肿瘤治疗的候选药物之一[7]。研究表明,YAP在控制宫颈癌进展中具有核心作用,其低表达与宫颈癌患者预后不良有关[8],提示靶向Hippo-YAP信号通路可调控宫颈癌的发展。此外有实验证实,Hippo-YAP信号通路与肿瘤耐药有关,抑制该通路可提高卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性[9]。基于以上证据,本研究以宫颈癌顺铂耐药细胞He La/DDP为对象,从Hippo-YAP信号通路出发,初步探究藁本内酯对宫颈癌耐药细胞的影响及潜在机制,以期为宫颈癌新型治疗药物的研发提供参考。
1、材料
1.1主要仪器
本研究所用主要仪器包括Spectra Max®Paradigm型酶标仪(美国Molecular Devices公司),Attune Cyt Pix型流式细胞仪、E-Gel Imager型凝胶成像系统(美国Thermo Fisher Scientific公司),BX53M型显微镜(日本Olympus公司)等。
1.2主要药品与试剂
藁本内酯原料药(批号HY-N0401A,纯度99.17%)、顺铂对照品(批号HY-17394,纯度99.84%)、ECL试剂(批号HY-K1005)均购自美国Med Chem Express公司;DMEM培养基(批号BC-M-030)购自南京森贝伽生物科技有限公司;Trizol试剂(批号B511311-0100)购自生工生物工程(上海)股份有限公司;CCK-8试剂盒(批号CK04)购自日本Dojido公司;AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(批号40302ES60)、RIPA裂解液(批号20101ES60)均购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;兔源YAP、TAZ、基质金属蛋白酶2(matrix metallopro‐teinase 2,MMP2)、切割型胱天蛋白酶3(cleaved-caspase-3)、caspase-3、β-肌动蛋白(β-actin)抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G二抗(批号分别为4912S、83669S、4022S、9661S、9662S、4967S、7074S)均购自美国CST公司;重组兔增殖细胞相关抗原Ki67抗体(批号为ab16667)购自英国Abcam公司。
1.3细胞
人宫颈癌顺铂耐药细胞He La/DDP(批号CL0677)购自湖南丰晖生物科技有限公司。
2、方法
2.1细胞培养
取He La/DDP细胞,接种于含1%青-链霉素双抗和10%胎牛血清的DMEM培养基(以下称“完全培养基”)中,于37℃、5%CO2条件下培养。
2.2 He La/DDP细胞增殖情况检测
采用CCK-8法检测。取对数生长期的He La/DDP细胞,接种于96孔板中,常规培养过夜后,将细胞分为对照组、顺铂组(10μmol/L顺铂[10])和顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组(10μmol/L顺铂+25、50、100μmol/L藁本内酯,藁本内酯的剂量参考文献[11]和前期预实验结果设置),每组设置6个复孔。对照组细胞加入完全培养基,其余各组加入含相应药液的完全培养基。培养24 h,每孔加入CCK-8试剂10μL,孵育2 h后,使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值,并计算增殖抑制率[增殖抑制率=(1-实验组OD值)/对照组OD值×100%]。
2.3 He La/DDP细胞凋亡情况检测
采用流式细胞术检测。取对数生长期的He La/DDP细胞,接种于96孔板中,按“2.2”项下方法分组、干预。培养24 h,收集细胞,经磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后重悬;取上述细胞悬液100μL,依次加入AnnexinⅤ-FITC染液和PI染液各5μL,混匀,室温下避光孵育15 min后,使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率(即早期凋亡、晚期凋亡细胞之和与总细胞数的比值)。
2.4 He La/DDP细胞迁移能力检测
采用划痕实验检测。取对数生长期的He La/DDP细胞,经消化后重悬并接种于24孔板中,于各孔底部划线,用PBS清洗后,将细胞按“2.2”项下方法分组、干预。使用显微镜分别在培养0、48 h时记录各组细胞的划痕愈合情况,采用Image J软件分析并计算各组细胞的划痕愈合率[划痕愈合率=(0 h时的划痕面积-24 h时的划痕面积)/0 h时的划痕面积×100%]。
2.5 He La/DDP细胞侵袭能力检测
采用Transwell实验检测。取对数生长期的He La/DDP细胞,经消化后重悬并接种于预先用matrigel胶处理的Transwell小室的上层;取含10%胎牛血清的DMEM培养基,接种于Transwell小室的下层。将上室细胞按“2.2”项下方法分组、干预。培养24 h,收集穿膜细胞,用多聚甲醛固定,再以结晶紫染液染色,冲洗、晾干后,使用显微镜观察侵袭细胞(呈紫色)并计数。
2.6 He La/DDP细胞中YAP、TAZ m RNA表达水平检测
采用定量实时聚合酶链式反应(quantitative realtime PCR,q RT-PCR)法检测。取对数生长期的He La/DDP细胞,接种于96孔板中,按“2.2”项下方法分组、干预。培养24 h,收集细胞,以PBS清洗后加入Trizol试剂提取RNA;将所得RNA反转录为c DNA后进行PCR扩增。PCR反应体系包括正、反向引物各0.4μL,c DNA模板5μL,mix 10μL,dd H2O 4.2μL。PCR反应条件为95℃预变性30 s;95℃变性30 s,60℃退火5 s,循环38次;72℃延伸15 s。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,使用2-ΔΔCt法分析YAP、TAZ m RNA的表达水平,结果以对照组作为参照进行归一化处理。PCR引物序列及产物长度见表1。
表1 PCR引物序列及产物长度
2.7 He La/DDP细胞中相关蛋白表达水平检测
采用Western blot法检测。取对数生长期的He La/DDP细胞,接种于96孔板中,按“2.2”项下方法分组、干预。培养24 h,收集细胞,用PBS清洗后加入RIPA裂解液提取总蛋白,蛋白经定量后进行变性处理。取变性蛋白适量,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至聚偏二氟乙烯膜上,用脱脂奶粉于4℃下封闭过夜;洗膜后,加入YAP、TAZ、MMP2、Ki67、cleavedcaspase-3、caspase-3、β-actin一抗(稀释度均为1︰1 000),4℃下孵育过夜;洗膜后,加入相应二抗(稀释度为1︰5 000),室温下孵育1 h;洗膜后,以ECL试剂显色,再用凝胶成像系统成像。使用Image J软件分析各蛋白条带灰度值,以目的蛋白与内参蛋白(β-actin)的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平,并计算cleaved-caspase-3与caspase-3蛋白的表达水平比值(cleaved-caspase-3/caspase-3)。
2.8统计学方法
采用Graph Pad Prism 7.0软件对数据进行统计分析。数据以表示。多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。
3、结果
3.1藁本内酯对He La/DDP细胞增殖抑制率的影响
与对照组比较,顺铂组细胞的增殖抑制率显著升高(P<0.05);与顺铂组比较,顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组细胞的增殖抑制率亦显著升高,且呈浓度依赖性(P<0.05)。结果见图1A。
图1藁本内酯对He La/DDP细胞增殖抑制率、凋亡率的影响(x±s,n=6)
3.2藁本内酯对He La/DDP细胞凋亡率的影响
与对照组比较,顺铂组细胞的凋亡率显著升高(P<0.05);与顺铂组比较,顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组细胞的凋亡率亦显著升高,且呈浓度依赖性(P<0.05)。结果见图1B、图2。
3.3藁本内酯对He La/DDP细胞迁移能力的影响
与对照组比较,顺铂组细胞的划痕愈合率显著降低(P<0.05);与顺铂组比较,顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组细胞的划痕愈合率亦显著降低,且呈剂量依赖性(P<0.05)。结果见图3、图4A。
图2藁本内酯对He La/DDP细胞凋亡影响的流式细胞图
图3藁本内酯对He La/DDP细胞迁移能力影响的显微图
图4藁本内酯对He La/DDP细胞迁移、侵袭能力的影响
3.4藁本内酯对He La/DDP细胞侵袭能力的影响
与对照组比较,顺铂组的侵袭细胞数显著减少(P>0.05);与顺铂组比较,顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组的侵袭细胞数亦显著减少,且呈浓度依赖性(P<0.05)。结果见图4B、图5。
3.5藁本内酯对He La/DDP细胞中YAP、TAZ m RNA表达的影响
与对照组比较,顺铂组细胞中YAP、TAZ m RNA表达水平均显著降低(P<0.05);与顺铂组比较,顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组细胞中YAP、TAZ m RNA的表达水平亦显著降低,且呈浓度依赖性(P<0.05)。结果见图6。
3.6藁本内酯对He La/DDP细胞相关蛋白表达的影响
与对照组比较,顺铂组细胞中YAP、TAZ、MMP2、Ki67蛋白的表达水平均显著降低,cleaved-caspase-3/cas‐pase-3显著升高(P<0.05);与顺铂组比较,顺铂+低、中、高浓度藁本内酯组细胞中YAP、TAZ、MMP2、Ki67蛋白的表达水平均显著降低,cleaved-caspase-3/caspase-3均显著升高,且呈浓度依赖性(P<0.05)。结果见图7。
图5藁本内酯对He La/DDP细胞侵袭能力影响的显微图
图6藁本内酯对He La/DDP细胞中YAP、TAZ m RNA表达的影响
图7藁本内酯对He La/DDP细胞中相关蛋白表达的影响
4、讨论
目前,传统化疗是临床治疗多种肿瘤的常规方法,其中顺铂是最早出现且最有效的铂类化疗药物。然而临床实践显示,肿瘤细胞常产生化学耐药性,从而使得化疗的长期疗效受限[12]。在外照射治疗期间每周静脉滴注1次顺铂是临床晚期宫颈癌患者的标准治疗方案[13]。然而,由于顺铂耐药的发生,使得宫颈癌患者的治疗效果不佳[14],故有必要寻找可降低宫颈癌细胞对顺铂耐药的方法或药物,以改善宫颈癌患者的预后。
藁本内酯是一种具有代表性的苯酞化合物,在当归挥发油中的含量超过50%[3]。研究表明,藁本内酯对多种疾病具有治疗潜力,包括卵巢癌、乳腺癌、糖尿病肾病、骨关节炎等[15]。Yin等[16]研究表明,藁本内酯可剂量依赖性地影响膀胱癌细胞的存活;Qi等[11]研究表明,在他莫昔芬耐药乳腺癌细胞中,藁本内酯可通过抑制自噬使细胞再次获得敏感性。上述研究表明,藁本内酯可减弱膀胱癌和乳腺癌细胞的存活率或耐药性,但该成分能否提高顺铂耐药宫颈癌细胞对顺铂的敏感性尚不清楚。
本研究结果显示,与对照组比较,顺铂单独处理He La/DDP细胞后,细胞的增殖抑制率显著升高,表明He La/DDP细胞对顺铂有一定的敏感性;随后,本研究以顺铂和不同浓度藁本内酯联合干预后,He La/DDP细胞的增殖抑制率进一步呈浓度依赖性升高,与前人研究结果类似[10],说明藁本内酯可增加He La/DDP细胞对顺铂的敏感性。本研究进一步通过划痕实验和侵袭实验发现,顺铂单独处理He La/DDP细胞后,其迁移和侵袭能力有所改变;随后,本研究以顺铂和不同浓度藁本内酯联合干预He La/DDP细胞,其划痕愈合率、侵袭细胞数进一步呈浓度依赖性降低,说明顺铂和藁本内酯联合可抑制He La/DDP细胞的迁移、侵袭。
MMP2、Ki67、cleaved-caspase-3、caspase-3分别是细胞迁移、侵袭、增殖和凋亡的标志物,抑制MMP2、Ki67表达和增加cleaved-caspase-3/caspase-3有利于增强宫颈癌耐药细胞对顺铂的敏感性[10,17,18]。细胞凋亡实验和Western blot实验结果显示,顺铂和不同浓度藁本内酯联合刺激可使He La/DDP细胞的增殖抑制率和凋亡率呈剂量依赖性升高,MMP2、Ki67蛋白表达显著下调,cleaved-caspase-3/caspase-3显著升高。这提示顺铂和藁本内酯联合能够促进He La/DDP细胞的凋亡,并提高He La/DDP细胞对顺铂的敏感性,有望作为辅助治疗宫颈癌的潜在化疗方案。
不受控制的细胞增殖是肿瘤发生的关键特征,YAP/TAZ是促进恶性肿瘤发展的Hippo信号通路的主要下游效应因子,其异常表达可引起肿瘤细胞的过度增殖,与多种肿瘤的发生、发展及细胞耐药性有关[6,19]。陈鹏等[20]研究发现,阻断YAP信号通路激活后,乳腺癌耐药细胞的耐药指数显著降低,提示该通路可能参与乳腺癌细胞的耐药过程。为探讨藁本内酯提高He La/DDP细胞顺铂敏感性的潜在机制,本研究检测了YAP、TAZ m RNA及蛋白的表达水平,结果显示,顺铂和藁本内酯联合可显著抑制He La/DDP细胞中YAP、TAZ m RNA及蛋白的表达,表明藁本内酯提高顺铂敏感性的作用可能与抑制Hippo-YAP信号通路有关。
综上所述,顺铂联合藁本内酯可减少宫颈癌顺铂耐药细胞He La/DDP的增殖,抑制其迁移、侵袭,并诱导其凋亡,提高耐药细胞对顺铂的敏感性;上述作用可能与Hippo-YAP信号通路被抑制有关。本研究结果尚需在宫颈癌动物模型中进行进一步验证。
参考文献:
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[18]周婷婷,沈卫星,陈桐庆,等.预知子提取物增敏奥沙利铂诱导结肠癌HCT116细胞凋亡的研究[J].南京中医药大学学报,2022,38(3):204-211.
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基金资助:国家自然科学基金项目(No.82100083);
文章来源:张文渊,王倩,张丽红,等.藁本内酯对宫颈癌细胞化疗耐药性的影响[J].中国药房,2024,35(13):1582-1587.
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专业分类:医学
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