肿瘤与感染是对肺部健康威胁最大的疾病。肺癌（lung cancer,LC）是全球范围内最致命的恶性肿瘤之一。我国LC的发病率及病死率均居于首位[1]，且处于不断加重的趋势，2022年新发病例数约87.1万，新增死亡病例数约76.7万。此外，传染性疾病的威胁持续存在，特别是急性传染性疾病如新型冠状病毒的全球大流行，对公共健康带来了前所未有的压力[2]；而以结核病为代表的慢性传染性病的挑战长期未缓解，根据2022年全球结核病报告[3]，全球约有25%的人口受到结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）的感染，新增结核病病例为1 060万例，导致大约160万人死亡。中国作为结核病的高负担国家，新增病例在全球排名第三，占全球总病例的7.4%，且结核病的高度空气传播性，使得其成为一直为新冠爆发之前的全球范围内单因感染性疾病死亡率之首[4]。不同于普通人群，肿瘤患者感染的风险更高，以LC合并肺结核（pulmonary tuberculosis,PTB）为例，LC患者PTB发病的风险是普通人群的6倍[5]；且Mtb感染可能导致更短的生存期[6];PTB导致的慢性炎症、免疫功能异常、瘢痕形成、基因变异等机制可能促进LC发生及发展，同时，LC本身及其治疗引起的免疫功能抑制也可能增加潜在结核发病或新感染的风险[7]。我们在临床实践中观察到LC-PTB的病例不少见，这种共病现象加剧了临床实践过程中的复杂性，关注此特殊患者群体具有重要的临床意义。针对LC-PTB患者的蛋白质组学研究鲜见报道，本研究旨在弥补该领域研究的不足。为此，我们以LC-PTB患者为对象，以单纯LC患者为对照，对LC-PTB患者的蛋白质组学进行检测和筛选，确定LC-PTB患者的候选差异蛋白，分析和探讨生物学功能，旨在为LC-PTB的生物学研究提供可能线索。

1、资料与方法

1.1 一般资料

本研究共纳入广州市胸科医院2023年7-11月的LC-PTB患者8例和LC患者10例。LC-PTB患者中，男7例，女1例；年龄56～72岁，平均（65±5.8）岁；Ⅰ期2例，Ⅲ期2例，Ⅳ期4例；非小细胞肺癌7例，小细胞肺癌1例。LC患者男7例，女3例；年龄42～75岁，平均（59±9.5）岁；Ⅰ期1例，Ⅱ期1例，Ⅲ期2例，Ⅳ期6例；非小细胞肺癌9例，小细胞肺癌1例。本研究获得广州市胸科医院医学伦理委员会（编号：KY-2024-004）批准。

纳入标准：（1）所有LC患者均经病理学确诊且未接受任何抗肿瘤治疗；（2)LC-PTB患者采样时，Mtb病原学检测均为阳性，符合《结核病分类WS196-2017》[8]菌阳性肺结核的诊断标准，涂片抗酸染色阳性、Mtb培养阳性以及Mtb核酸检测阳性。

排除标准：（1)LC-PTB组患者合并其他感染性疾病如人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒等；（2）其他部位恶性肿瘤、糖尿病患者；（3）自身免疫性疾病或接受可能影响免疫功能用药者。

1.2 研究方法

1.2.1 血清样本制备

采集外周血5 m L，以1 300r/min在4℃条件下离心10 min，取得血清冻存于-80℃冰箱待用。使用双缩脲酸蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。随后，对高速离心后的血清进行孵育、胰蛋白酶过夜酶解、二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行还原和烷基化处理，最后通过除盐和真空冷冻干燥以完成样品肽段的制备，准备进行液相色谱-质谱联用分析。

1.2.2 液相色谱-质谱联用分析

肽段用液相色谱流动相A相（0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液）溶解后使用超高效液相系统进行分离，分离后被注入纳喷雾电离（Nano Spray Ionization,NSI）离子源中进行电离，并进入Orbitrap Exploris 480质谱仪进行检测和分析：离子源电压设置为2 100 V，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。扫描范围设置为350～1 050 m/z，扫描分辨率设置为30 000～45 000。数据采集模式使用数据非依赖型扫描程序。

1.2.3 数据库检索

依据Homo＿sapiens＿9606＿SP＿20230103.fasta数据库（含20 389条序列）构建了理论二级谱库。使用Spectronaut（版本17）的Pulsar搜索引擎对DIA质谱数据进行分析，设置了包括两个漏切位点的容许、半胱氨酸Carbamidomethyl(C）固定修饰、以及甲硫氨酸氧化和蛋白N端乙酰化的可变修饰。同时，假发现率（False Discovery Rate,FDR）阈值设置为1%，鉴定的蛋白至少应含有一个特异性肽段。

1.2.4 生物信息学分析

利用京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)和基因本体论（Gene Ontology,GO)进行功能分类注释分析，并对差异蛋白进行KEGG和GO富集分析。利用Wol F Psort对差异表达蛋白进行亚细胞定位分析。对差异表达蛋白与STRING蛋白互作网络数据库比对后，按照置信度得分（confidence score)>0.7提取得到差异表达蛋白互作关系，然后通过Cytoscape对差异表达蛋白进行蛋白质-蛋白质互作（Protein-Protein Interaction,PPI）网络分析进行可视化展示。

1.3 统计学方法

根据重复次数不同采用以下方法：3次及以上重复：计算两组样本中蛋白的相对定量值均值之比（Fold Change,FC），并进行t检验计算P值，以P<0.05为显著性标准。蛋白相对定量值需Log2转换。两次重复：计算两组样本中蛋白比值的均值作为FC，并计算标准变异系数（CV），以CV<0.1为显著性标准。无重复：直接计算两个样本中蛋白相对定量值之比作为FC。对所有情况，P<0.05时，FC超过1.5倍视为显著上调，FC小于1.5倍视为显著下调。对两组间差异蛋白采用费希尔精确检验（Fisher′s exact test）方法进行KEGG及GO富集分析。

2、结果

2.1 LC-PTB及LC的蛋白质组学图谱及差异蛋白分析

质谱数据在完成数据库检索后，需通过肽段长度、肽段数量、蛋白覆盖度及蛋白分子量分布等质控评价，确保结果达到质量标准。韦恩图可见，LC-PTB组共检测出4 950种蛋白质，LC组共检测出5 124种蛋白质，两组交集的蛋白数量为4 889种，296种蛋白被鉴定为能够区分LC-PTB与LC（图1A）。差异表达蛋白热图（图1B）直观展现了LC-PTB与LC蛋白表达差异，从整体层面描绘了LC-PTB和LC所有差异表达蛋白的相对水平。

图1 LC-PTB与LC的外周血差异蛋白分析

2.2 LC-PTB与LC外周血差异蛋白筛选

依据过滤标准（P<0.05时，FC超过1.5倍视为显著上调，FC小于1.5倍视为显著下调），本研究筛选出了190种差异表达蛋白，包括58种表达水平上调和132种表达水平下调的蛋白质。此外，我们筛选出变化倍数前5位的上调蛋白对应基因名为HSBP1L1、IRIP3、CHGA、ADA2和KBTBD8以及下调最显著的蛋白对应基因名是GLS2、GOSR2、MAP3K1、LCMT1及SRRM2（表1），并标记于火山图（图2A）。而P值最显著的前5位上调蛋白对应基因名包括QRICH2、LAMA4、SH3BGRL2、CCL23、和TXNDC17及下调最显著的蛋白对应基因名则是B4GALT1、RAB4B、ACOT7、LCMT1及RPS6KB1（见表2）。此外，我们重点分析了表1中列出差异蛋白质，展示了上调变化倍数最大的5种蛋白的表达情况（图2B）和而下调变化倍数最大的5种蛋白的表达情况（图2C）。

2.3 差异蛋白KEGG通路及GO分类注释

KEGG通路分析注释了6种不同的生物学分类（图3A），包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢、有机系统。在细胞层面，最为关键的生物化学过程涵盖物质的运输与分解代谢、细胞的增长与凋亡、以及真核细胞的群体相互作用；在环境信息处理方面，重点在于信号转导和信号分子的相互作用；遗传信息的处理涉及蛋白质的折叠、分选、降解以及RNA的转录和翻译过程；在人类疾病的范畴内，病毒性传染病、癌症以及细菌性传染病是研究的重点；代谢领域则集中在综合代谢途径、碳水化合物代谢和脂质代谢的关键过程；至于有机体系统，主要聚焦于免疫系统、内分泌系统以及生物对环境变化的适应机制。GO分析主要包括3个方面（图3B）：生物过程（Biological Process,BP）、细胞组分（Cellular Component,CC）、分子功能（Molecular Function,MF）。BP分类中，调控机制、有机物代谢和细胞过程占据中心地位；CC分类则以细胞内部结构、细胞质和细胞器为主；MF分类则侧重于蛋白质结合能力和酶催化功能。  

表1 LC-PTB与LC变化倍数最大的差异表达蛋白  

表2 LC-PTB和LCP值最显著的差异表达蛋白 

2.4 差异蛋白的亚细胞定位和KEGG通路及GO富集分析

亚细胞定位分析发现190个差异表达蛋白在细胞质（n=55,29.0%）中占比最多，在细胞核（n=43,22.6%）中占比相对较多，而在细胞外基质（n=37,19.5%）、线粒体（n=20,10.5%）和细胞质膜（n=20,10.5%）中占比相对较少，在内质网（n=6,3.2%）和其他（n=3,1.6%）中占比最少。通过Fisher′s精确检验对190种差异表达蛋白的通路富集进行显著性分析，设定P值小于0.05为显著差异标准。在KEGG分析中，共识别出28条显著富集的代谢通路，其中包括胃酸分泌、胆汁分泌、胰岛素分泌、化学致癌-受体激活等关键通路；而GO分析则共鉴定出273条显著富集的通路，具体到BP类别中有176条，突出了G蛋白偶联受体信号通路、中心粒复制等为最显著富集的通路；在CC类别中识别出34条，以内质网至高尔基体运输囊泡膜、非活动性性染色体、循环免疫球蛋白复合体为最显著；MF类别中共有63条显著富集，其中多聚G结合、酰胺结合、肽结合等功能通路富集度最高。

2.5 差异表达蛋白的蛋白质互作网络富集分析

为进一步分析190种差异表达蛋白质的PPI，我们将这些蛋白质与STRING数据库进行了匹配，并选取置信度得分>0.7的互作关系，从而发现关键的蛋白质交互信息。结果发现SORT1、SAR1B、RPS6KB1、VWF、SHC1、SRPRB、CTSD、TARDBP、RPLP0、PSMA2、RPS6、XPO1、PRKACB、HLA-DRB1等在LC-PTB中较关键（图4）。

图2 LC-PTB与LC的外周血差异蛋白的强度分析

图3 差异蛋白KEGG及GO通路分类注释图  

注：A，横坐标代表蛋白数，纵坐标代表KEGG Pathway＿level 2分类条目，不同颜色代表KEGG Pathway＿level 1分类条目。B，横坐标代表蛋白数，纵坐标代表Go＿level 2分类条目，不同颜色代表GO＿level 1分类条目

图4 差异蛋白的互作网络分析

3、讨论

LC-PTB是一组在临床实践中不少见的独特人群，其诊断及治疗需要兼顾的因素繁杂，其生物学方面的研究对其临床发病及诊治具有重要意义。本研究通过蛋白组学技术发现的LC-PTB人群具有独特的蛋白组学特征，差异蛋白的功能分析提示其包括调节免疫系统在内的复杂生物学功能，这些差异蛋白有望能为LC-PTB生物学机制研究提供进一步的线索。

近年来，LC-PTB发病面临着越来越复杂的背景，其中包括肿瘤治疗手段进步带来的生存时间延长，导致潜伏结核感染人群的发病。LC-PTB从发病、治疗到预后均存在复杂且动态变化的生物学机制，其中以免疫系统的复杂相互作用最为典型。在传统细胞毒药物化疗、放疗等免疫抑制治疗手段之外，免疫检查点抑制剂在LC领域的广泛应用，更进一步凸显出LC和PTB二者在免疫系统层面的交互作用[9]。此外，LC本身的免疫系统紊乱，也对其合并Mtb等感染增加了发病的风险，并对其治疗等全过程管理提出诸多挑战。除Mtb感染外，其他病原体感染也可能对肿瘤的发生发展产生重要的影响，而使用高通量的蛋白组学技术有望能为肿瘤合并感染人群的研究提供重要线索[10]。

蛋白质组学在LC和PTB的研究中应用较为广泛。LC层面，通过蛋白质组-基因组分析发现HMGB3和CASP10可作为小细胞肺癌预后生物标志物[11]；而在肺腺癌中则根据免疫亚型分析强调了STK11与免疫冷静行为的联系[12]。在PTB蛋白组学研究方面发现，在活动性PTB患者的血清外泌体中发现了一系列差异蛋白如HSP70、CD81、MHC-I、TSG101、LBP和CD36等[13]。本研究关注与LC-PTB共病这一特殊人群，通过蛋白组学数据分析结果，发现了一些重要的差异蛋白。其中ADA2(Q9NZK5）在结核分枝杆菌感染环境中分泌增加，并影响调节性T细胞，进而调节免疫反应[14]，同时ADA2活性的增加被证明可以区分活动性结核病和潜伏性结核感染[15]。TCGA数据库分析进一步显示ADA2基因CECR1的表达增加与多种实体瘤患者的生存率提高相关[16]，而聚乙二醇化ADA2在小鼠模型中通过调节腺苷水平及其酶活性抑制肿瘤生长[17]。此外，MAP3K1(Q13233）蛋白通过激活下游JNK参与Mtb H37Rv感染小鼠间充质干细胞的炎症反应，并与细胞存活促进相关[18]。MAP3K1的激活还与细胞生存有关[19]，其功能丧失的突变会使癌细胞对MEK抑制剂更敏感[20]。最后，GLS2(Q9UI32）可能通过增加NADPH的水平来降低活性氧的水平在转移性肺癌中高表达[21]，在Mtb感染环境下，GLS2上调，产生细胞因子从而影响免疫反应[22]。本研究发现GLS2和MAP3K1的表达下调，是否与LC-PTB共病状态下蛋白表达的复杂性有关，值得进一步探讨。

此外，差异表达蛋白的进一步分析发现其在免疫、代谢、分泌调控和神经系统功能等关键生物学过程可能发挥重要作用。有研究报道SORT1在TB中促进吞噬体成熟和增强巨噬细胞杀菌能力[23]，在LC中通过调节表皮生长因子受体信号传递来抑制肿瘤生长[24]。HLA-DRB1在癌症和感染性疾病中的作用不容忽视，通过在抗原呈递细胞中的表达和激活肿瘤微环境中的T细胞发挥作用，尤其在肺腺癌中的影响已被广泛研究[25,26]；此外，其多态性与结核病发展相关[27]。我们的发现进一步证实了SORT1、HLA-DRB1可能通过免疫功能调节在LC-PTB发生发展过程中发挥重要作用。

本研究尚有一定的局限性。首先，研究样本的数量仍有不足，可能影响了结果的普适性，虽然包含了不同LC病理类型的样本，但未能就不同LC病理类型间的差异进行分析。其次，未考虑不同PTB间的差异，如耐药PTB与敏感PTB等。最后，筛选出的差异表达蛋白尚未经过独立功能验证，其具体的生物学作用需要进一步证实。后续拟从组织样本对本研究的相关结果进一步验证，同时对差异蛋白的生物学功能进行确认。同时，纳入更多类型的研究对象，进而从多个角度确认本研究的相关结果，为后续LC-PTB的生物学机制研究提供重要支撑。

本研究通过蛋白组学图谱对LC-PTB疾病特征进行了较为全面的描述，差异蛋白具有较为复杂的生物学功能，这些差异蛋白有望能为LC-PTB的生物学机制研究提供可能的线索。

参考文献:

[4]吴惠忠,胡锦兴.结核病传播研究进展[J].实用医学杂志,2023, 39(19):2424-2427.

[8]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.结核病分类(ws196—2017)[J].新发传染病电子杂志,2018(3):191-192.

[10]崔兰兰,张革,徐邦牢.牙龈卟啉单胞菌感染性食管鳞癌细胞外泌体蛋白组学分析[J].实用医学杂志,2023, 39(17):2171-2175.

基金资助:国家重点研发计划(编号:2022YFC2304800); 广州市科技计划项目(编号:2023A03J0539,2023A03J0992,2023A03J0534);

文章来源:周文娣,林佳敏,琚岱晨,等.肺癌合并肺结核的蛋白组学图谱及差异表达蛋白功能分析[J].实用医学杂志,2024,40(13):1814-1821.