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外周血miR-299和miR-23a在PE患者诊断及预后评估中的应用

2024-06-25 19 上传者：管理员

摘要：目的:探讨外周血miR-299和miR-23a在子痫前期(PE)患者诊断及预后评估中的应用价值。方法:回顾性选取2020年1月至2023年1月在十堰市人民医院就诊的84例PE患者为研究对象(观察组),并随机选取同期73例正常孕妇作为对照组。检测血清中miR-299和miR-23a表达量。多因素Logistic回归模型分析PE孕妇的影响因素。采用ROC曲线分析miR-299和miR-23a对PE的诊断价值；通过Kaplan-Meier法分析miR-299和miR-23a表达水平对观察组孕期生存的影响。结果:观察组血清中miR-299和miR-23a水平(3.13±0.84、1.94±0.55)显著高于对照组(2.34±0.73、1.47±0.43)(P<0.05)。Logistic回归分析显示，miR-299和miR-23a水平是PE发生的危险因素(P<0.05)。miR-299和miR-23a两者联合诊断结果优于任何1项单独分析(Z两项联合-miR-299=2.067,P=0.038;Z两项联合-miR-23a=2.086,P=0.037)。患者中miR-299和miR-23a高表达组的死亡率显著高于低表达组(P<0.05)。结论:PE患者血清中miR-299和miR-23a表达水平均上调，两者联合对PE有一定的诊断价值，且其表达水平与PE患者的预后密切相关。

关键词：
miR-23a
miR-299
子痫前期
诊断
预后
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子痫前期(PE)是妊娠期第20周后发生的多系统性疾病，该病的临床特点是患者出现高血压和蛋白尿，或出现高血压伴随终末器官功能障碍。若病程持续发展，将会导致母婴出现严重的并发症，如早产、胎儿营养不良及生长受阻、孕妇产后出血等并发症，甚至危害孕妇及胎儿生命[1,2]。然而，目前PE的发病机制和病因尚未清楚。有研究表明，滋养细胞是胎盘形成的主要细胞，滋养细胞在子宫螺旋动脉重塑过程中起重要作用，前者分化缺失和侵入不足导致后者重塑失败，进而不能为胎盘和胎儿提供充足营养支持。此外，滋养细胞分化缺失还会导致滋养层细胞合成不足[3]。因此，滋养细胞若在孕妇妊娠期出现异常表达，就有可能增加胎盘异常和PE发生的概率[4]。因此，有学者建议，将胎盘中滋养细胞的凋亡作为PE发病的生物标志物[5,6,7]。但是，大量的滋养细胞凋亡在临床检测上存在一定困难。

微小RNAs(miRNAs)是一种长度约22 bp的内源性非编码单链RNA分子，广泛参与动植物基因转录后的调控工作。已有大量研究[8,9,10]表明，miRNA的异常表达与PE的发生有关。Fan等[11]研究发现，miR- 23a在PE患者的胎盘组织中呈现高表达状态。Gao等[12]在研究重度PE孕妇胎盘组织时发现，miR- 299的表达水平显著高于正常孕妇。但miR- 299、miR- 23a对PE的诊断及预后评估未有研究，基于此，本研究以血清中miR- 299和miR- 23a在PE患者中的表达水平为切入点，以期为PE患者的诊断提供有效的可选择的临床指标，以更好地评估和预测PE患者身体状态，及时调整治疗和护理方案，更好地改善患者预后状态。

1、资料和方法

1.1 一般资料

回顾性选取2020年1月至2023年1月十堰市人民医院接诊的84例PE患者作为观察组，同期本院合计接诊1 031名孕妇，PE发病率约为8.15%。随机选取同期与患者不存在人口差异(P>0.05)的103名正常孕妇作为对照组。观察组年龄18～40岁，平均(29.27±5.76)岁；对照组年龄21～37岁，平均(27.89±4.57)岁。观察组体质量指数(BMI)20.38～26.83 kg·m-2,平均(23.96±1.84) kg·m-2;对照组BMI指数19.22～25.50 kg·m-2,平均(22.65±1.39) kg·m-2。纳入分析的临床指标有高血压史、肾炎史、糖尿病史、PE家族史、是否初产等。根据PE孕妇正常生产时的生存情况将PE孕妇分成生存组(70例，存活率83.33%)和死亡组(14例，死亡率16.67%)。

样本采集：入院后用不加抗凝剂抗凝管采集正常孕妇和经诊断[13]后确定为PE的孕妇清晨空腹外周静脉血5 mL,3 000 r·min-1高速离心10 min, 取上清液做后续检测分析。剩下的血液样本分离血清血浆，做好标记，-80 ℃冰箱长期保存，以备后用。样本避免反复冻融。本研究已获得十堰市人民医院伦理委员会审核批准。

1.2 患者诊断、纳入与排除标准

PE孕妇诊断标准：(1) 孕妇妊娠周期≥20周者；(2) 收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg者；同时伴随下列任1项者即可确诊：(1) 尿蛋白≥0.3 g·24 h-1;(2) 尿蛋白/肌酐值≥0.3;(3) 随机尿蛋白阳性；(4) 无尿蛋白但出现连累其他器官(心、肝、脾等内脏)或系统(血液系统、神经系统、胎儿- 胎盘系统等)。纳入标准：(1) 患者经诊断后符合上述诊断标准[14];(2) 对照组为身体正常孕妇；(3) 具备完整的分娩记录。排除标准：(1) 近半年内服用影响脂类代谢药物者；(2) 合并恶性肿瘤及免疫功能异常者；(3) 临床资料不完整者；(4) 有PE病史者。

1.3 研究方法

使用电子血压计测量两组个体的收缩压和舒张压；采用血液全自动生化仪测量两组血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平；血清中妊娠相关蛋白A(PAPP- A)和血清胎盘生长因子(PLGF)水平严格按照ELISA试剂盒(赛默飞世尔科技公司)说明书进行操作。最后采用酶标仪读取标准样本和待测样本在450 nm处吸光度(OD),根据标准样本绘制标准曲线，最后根据标准曲线计算血清中PAPP- A和PLGF水平。

外周血miR- 299和miR- 23a表达水平采用实时荧光定量PCR(RT- PCR)法检测。miRNA严格按照miRcute血清血浆miRNA提取分离试剂盒(DP503)(天根生化科技有限公司)说明书提取，提取miRNA后迅速反转录成cDNA [miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR211)(天根生化科技有限公司)]。设计miR- 23a、miR- 299引物，并委托深圳华大基因公司合成引物序列，见表1。使用PCR仪测量miR- 299和miR- 23a的表达水平，以U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。

1.4 统计学处理

本研究所收集的数据资料均通过SPSS 25.0软件进行统计学相关分析。计量数据均符合正态分布，以

描述，根据分组数据行t检验；计数资料以例表示，组间差异行χ2检验；采用多因素Logistic回归分析影响孕妇发生PE的因素；通过受试者工作特征(ROC)曲线及曲线下面积(AUC)分析miR- 299和miR- 23a水平对PE的诊断价值；采用Kaplan- Meier法分析不同miR- 299和miR- 23a表达水平对孕妇预后生存的影响。P<0.05为差异有统计学意义。

表1 研究用到的引物序列

2、结果

2.1 观察组和对照组临床指标间的差异

观察组和对照组的临床资料分析结果表明，是否患有PE与孕妇孕期和是否是初产无关(P>0.05);与孕妇的年龄、BMI、高血压史、肾炎史、糖尿病史和PE家族史均有关系，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组的HDLC显著低于对照组(P<0.05),收缩压、舒张压、LDLC、TC、TG、PAPP- A、PLGF、miR- 299和miR- 23a均显著高于对照组(P<0.05)。见表2、3。

2.2 影响PE发生因素的Logistic回归分析

以孕妇是否患有PE为因变量(是=1,否=0),将2.1结果中的收缩压、舒张压及血清中HDLC、LDLC、TC、TG、PAPP- A、PLGF、miR- 299和miR- 23a水平作为为自变量，进行多因素Logistic回归分析。分析结果显示，HDLC是PE发生的保护因素(P<0.05),年龄、BMI、高血压史、肾炎史、糖尿病史、PE家族史、收缩压、舒张压以及血清中HDLC、LDLC、TC、TG、PAPP- A、PLGF、miR- 299和miR- 23a水平是PE发生的危险因素(P<0.05)。见表4。

2.3 血清中miR- 299和miR- 23a表达量对孕妇发生PE的预测价值

ROC曲线结果表明，血清中miR- 299、miR- 23a和两者联合诊断PE的AUC分别为0.710、0.709和0.813,且两者联合诊断结果优于miR- 299和miR- 23a任何1项单独分析(Z两项联合- miR- 299=2.067,P=0.038;Z两项联合- miR- 23a=2.086,P=0.037)。见表5、图1。

2.4 血清中miR- 299、miR- 23a水平与PE患者孕期内预后生存关系评估

以观察组miR- 299和miR- 23a表达水平的平均值为界，将miR- 299和miR- 23a的表达水平分为高表达组和低表达组。观察组血清中miR- 299和miR- 23a的表达水平之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表2 观察组和对照组临床资料比较

表3 观察组和对照组生理指标比较

表4 Logistic回归分析孕妇是否患有PE的影响因素

表5 血清中miR- 299、miR- 23a水平对孕妇是否患PE的预测评估

图1 血清中miR- 299、miR- 23a水平对孕妇PE预测评估的ROC曲线

结合Kaplan- Meier法对观察组血清miR- 299和miR- 23a表达水平与孕妇孕期生存状况关系进行评估，结果表明，观察组中miR- 299高表达的患者在整个孕期内总生存率(33/44,75.00%)显著低于miR- 299低表达患者(37/40,92.50%)(log rank χ2=4.680,P=0.031);miR- 23a高表达患者在整个孕期内总生存率(30/42,71.43%)显著低于miR- 23a低表达患者(40/42,95.24%)(log rank χ2=7.718,P=0.005)。见图2、3。

3、讨论

2023年5月22日是全球第7个世界PE日，这表明PE已经受到国际社会的广泛关注。据世界卫生组织统计显示，世界范围内每年因PE死亡的妇女胎儿分别有7.6万和50万[15]。此外，发展中国家与不发达地区的发病率更高，危害更严重[16]。临床研究发现，早期预警机制可以有效防控PE的发生发展，将PE遏制在萌芽阶段，从而改善母婴生存状况[17]。有研究表明，当孕妇孕期患有PE时血脂中的LDCL和TC水平会显著增加，HDCL水平显著降低，伴随大量尿酸产生和血小板迅速减少[18,19,20,21]。本研究中作者分析了血清中的LDCL、TC、HDCL水平，发现变化趋势与既往的研究结果一致。PE的病因复杂，受到多因素的影响，如怀孕年龄、BMI、慢性疾病史、血脂水平和孕妇个体差异等。本研究通过对比两组受试者临床病理资料并结合Logistic回归分析显示，上述因素直接或间接参与了PE的发生发展，这为今后PE的预防和护理提供了有效的理论参考。

表6 观察组miR- 299和miR- 23a表达分组

图2 PE患者血清中miR- 299表达水平与患者孕期总生存率关系

图3 PE患者血清中miR- 23a表达水平与患者孕期总生存率关系

研究资料显示，组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)在胚胎发育过程中以及细胞免疫因子信号传递中起着核心作用[22]。Gao等[12]发现重度PE患者胎盘中HDAC2的表达水平显著低于正常孕妇，该团队还发现HDAC2是miR- 299的下游靶点。另一项生物信息学结果揭示miR- 23a与HDAC2也存在靶向关系[22]。据Fan等[11,12]研究显示，miR- 23a和miR- 299的过表达会抑制HDAC2的表达，从而抑制滋养细胞的侵袭和迁移，进而导致PE的发生。本研究中作者的临床数据显示PE患者血清中miR- 23a和miR- 299表达水平远远高于正常孕妇，表明miR- 23a和miR- 299的水平高表达可能导致孕妇患有PE。进一步Logistic回归分析表明，其高水平表达在PE发病过程中可能起危害作用，其发挥调控的作用机制是我们下一步的研究内容。

ROC曲线分析显示，血清中miR- 299和miR- 23a表达水平对预测孕妇PE病情有一定的价值，且两者联合评估结果优于miR- 299和miR- 23a任何1项单独评估，这表明两者联合诊断PE具有较高的评估价值。生存曲线显示，血清中miR- 299和miR- 23a表达水平在一定程度上可以反映出PE患者的预后生存情况，即miR- 299和miR- 23a同时高表达的PE患者预后差。因此，在临床上可以通过测量血清中miR- 299和miR- 23a的表达水平及时干预和调整治疗和护理策略，减少PE的发生，改善患者的预后。

简而言之，miR- 299和miR- 23a水平的上调是孕妇患PE的危险因素，两者联合对PE有较高的诊断价值，且两者与预后关系密切。但本研究的样本量有限，且没有深入探索miR- 299和miR- 23a过表达影响PE发生的机制及其对患者预后的影响，因此，作者计划下一步扩大样本量进行深入研究。

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文章来源:刘博,王运菊,刘孟彬,等.外周血miR-299和miR-23a在PE患者诊断及预后评估中的应用[J].东南大学学报(医学版),2024,43(03):403-409.