肝细胞癌(HCC)是癌症相关死亡的第四大原因，在全球新发病例中排名第六，根据统计数据分析，HCC患者5年生存率低至12%[1]。HCC发生的危险因素，主要包括慢性肝炎病毒感染、脂肪萎缩性糖尿病、过量饮酒、非酒精性脂肪性肝病等[2]。目前手术切除是HCC的主要治疗方法。然而，HCC具有较大的隐匿性，大多数患者发现并就诊时就已经是中晚期阶段，导致手术切除后HCC患者的预后效果和生存期大打折扣。并且，对于无法进行手术治疗的患者所能够采取的治疗方式有限[3]。

目前临床上应用的血清肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)特异度不强，在肝炎、肝硬化、妊娠或者是胚胎源性的肿瘤等情况下也会导致血清中AFP的含量升高。因此在临床血清学诊断上亟须寻找针对HCC的新型特异性标志物，能够在早期诊断患者肝癌状态，并辅助评估患者预后。

外周血中小核仁RNA(snoRNAs)是一类全长60～300个核苷酸的非编码RNA,可以根据其保守区域分为C/D snoRNAs和H/ACA snoRNAs[4]。其中box C/D snoRNA主要指导2′-O-甲基转移酶纤维蛋白对RNA进行甲基化，box H/ACA snoRNA主要进行假尿苷修饰[5]。这两种类型的snoRNAs都能结合特定的保守蛋白伴侣，形成被称为小核仁核糖核蛋白复合体(snoRNPs)[6]。并且，box C/D和H/ACA的snoRNAs在整个进化过程中高度保守，并以体液高丰度存在于迄今为止所检测的所有真核生物中[7]。但近年来的研究发现[8],snoRNAs在许多疾病的发生、发展、诊断，预后评估中都有着显著的差异性表达并且扮演着重要的调控作用，尤其在HCC、乳腺癌，肺癌，卵巢癌等多种恶性肿瘤[9,10]。SnoRNA的高保守特性，血液中存在的高丰度优势，组织样本中的高差异表达使得其具备有作为癌症标志物的基本属性[11]。

本研究利用外周血提取总RNA的方法并借助实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术主要针对5种snoRNAs(SNORD52、SNORD17、SNORD126、SNORA42和SNORD105)在HCC患者相较于健康人血液中的表达量差异，并且联合AFP来提高对HCC的诊断价值。

1、资料与方法

1.1 一般资料

选取2022年12月至2023年8月于本院就诊的年龄大于40岁的男性HCC患者35例为HCC组(其中AFP阳性30例，AFP阴性5例),均经过病理诊断证实且未进行临床手术操作。另选择同期年龄大于40岁的男性体检健康者35例为对照组。该研究经过本院伦理审查委员会批准(KY:2020146)。

1.2 方法

1.2.1 标本收集

收集符合纳入实验研究的标准的肝癌患者以及健康体检者血液标本各35例，并将HCC患者术前术后以及健康体检者新鲜血液进行EDTA抗凝处理后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 引物设计

从NCBI网站查阅下载所研究的snoRNA序列，设计引物后通过基于与局部比对算法的搜索工具(BLAST)进行引物评估。委托上海生工生物工程公司合成SNORD52、SNORD17、SNORD126、SNORA42、SNORD105及内参U6引物。见表1。

表1 snoRNA引物序列

1.2.3 总RNA提取

根据柱式全血总RNA抽提纯化试剂盒(上海生工生物工程公司)说明书严格操作：取200 μL抗凝血液，加入500 μL DEPC-treated ddH2O震荡混匀，8 000 r/min 4 ℃离心1 min, 弃上清。加入200 μL Buffer Rlysis-RG,立即震荡混匀，室温放置3 min。再加入400 μL Buffer NS,震荡混匀。12 000 r/min 4 ℃离心5 min, 取上清液于1.5 mL RNase-free的离心管中。向上清液中加入1/2体积无水乙醇，充分混匀。将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液全部加至吸附柱中，静置1 min, 室温12 000 r/min 离心1 min, 倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管中，加入500 μL GT Solution, 静置1 min, 室温10 000 r/min 离心1 min, 倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管中，加入500 μL NT Solution, 静置2 min, 在室温下10 000 r/min 离心1 min, 倒掉收集管中废液。将吸附柱放回收集管中，在室温下12 000 r/min 离心2 min。将吸附柱放入RNase-free的1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入30～50 μL DEPC-treated ddH2O,静置2 min, 在室温下12 000 r/min 离心2 min, 将所得到的RNA溶液置于-70 ℃保存。取2.0 μL RNA使用NanoDrop 1.0(NanoDrop Technologies) 测定提取的RNA样品的浓度和纯度。另取1.0 μL RNA通过琼脂糖凝胶电泳对RNA完整性进行检测。

1.2.4 逆转录反应

根据AMV 第一链cDNA合成试剂盒(上海生工生物工程公司)说明书严格操作。样本总反应体系(20 μL):1 μg总RNA以上产物，1 μL Oligo dT(0.56 μg/μL,4 μL RNase free ddH2O 在冰浴的条件下加样后轻轻混匀离心3～5 s, 65 ℃温浴5 min再冰浴30 s然后离心 3～5 s。将上述体系在冰浴的条件下加入以下组分：4 μL 5×Reaction Buffer, 1 μL RNase Inhibitor (40 U/μL),2 μL dNTP Mix(10 mmol/L),2 μL AMV RT(10 U/μL)轻轻混匀离心3～5 s, 在PCR仪上进行反转录反应。反应条件：42 ℃ 45 min, 85℃ 5 min。将逆转录产物置于-20 ℃保存用于后续实验。

1.2.5 PCR扩增

按照2×SG Fast qPCR预混液(BBI,中国)的试剂盒说明书严格操作并使用Bio-Rad CFX96 qPCR仪(Biorad)进行qPCR。每个基因设置3个复孔，另外每个样本相同设置1个U6内参基因。qPCR总反应体系(20 μL):10 μL 2×SG Fast qPCR预混液，0.4 μL 10 μM 上、下游引物，2 μL DNF buffer, 6 μL cDNA以上产物，1.2 μL ddH2O水。反应条件：95 ℃ 3 min; 95 ℃ 3 s, 60 ℃ 30 s, 40个循环。

1.2.6 相对表达水平计算

通过qPCR的温度熔解曲线判断实验准确性。以U6为内参，采用2-ΔΔCt方法计算各个snoRNA在血液中的水平。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 9 以及SPSS26.0统计学软件进行数据分析，计量资料以

表示，HCC组间比较采用独立样本t检验，利用受试者工作特征(ROC)曲线分析具有差异表达snoRNA以及联合指标应用对HCC的诊断价值。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 血液中5种snoRNAs的相对表达水平

HCC组(AFP阳性30例)相较于对照组表达SNORD52、SNORA42显著升高；SNORD17表达显著下降，差异有统计学意义(P<0.05),见图1。其余两条SNORD126、SNORD105表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本文又验证了在AFP阳性的HCC患者中有意义的SNORD52、SNORA42及SNORD17在AFP阴性患者中差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

图1 正常组与肝癌组(AFP阳性30例)血液中snoRNA的相对表达水平比较   下载原图

注：***为P<0.001,ns为差异无统计学意义；○为对照组；△为HCC组(AFP阳性)。

图2 正常组与肝癌组(AFP阴性5例)血液中snoRNA的相对表达水平比较   下载原图

注：*为P<0.05,ns为差异无统计学意义；○为对照组；△为HCC组(AFP阴性)。

2.2snoRNAs与甲胎蛋白(AFP)的原发性肝癌诊断价值

鉴于上述表达差异有统计学意义的3条snoRNA进行ROC曲线分析其临床诊断价值。以SNORD17、SNORA42、SNORD52作为检验变量，分别对对照组和HCC组作为检验标量，以灵敏度为Y轴，以“1-特异度”为X轴分别绘制ROC曲线，同时，AFP联合snoRNAs进行绘制ROC曲线。结果表明snoRNA单一及联合指标均具有临床诊断价值，但均小于1,将3条snoRNA与AFP联合后曲线下面积(AUC)=1;说明SNORD17、SNORA42、SNORD52表达量与原发性HCC密切相关，snoRNAs与AFP联合能够有效的提高临床诊断价值。见表2。

2.3snoRNAs术前术后的差异分析

鉴于上述表达差异有统计学意义的3条snoRNA进行HCC组术前术后表达量分析，以SNORD52、SNORD17以及SNORA42为X轴，表达量为Y轴，进行术前及术后进行比较，结果表明术后SNORD52和SNORA42表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.001),SNORD17表达量差异无统计学意义(P>0.05),进一步说明SNORA42和SNORD52与HCC密切相关。见图3。

表2 snoRNA以及联合指标用于原发性肝癌诊断的ROC曲线分析

图3 肝癌组术前与术后血液中snoRNA的相对表达 水平比较   

3、讨论

HCC是一种高侵袭性的恶性肿瘤，与全球范围内相当大的社会经济负担相关。中国占全球肝癌病例及相关死亡的近50%,尽管城市和农村地区在发病率和死亡率方面存在显著差异[12]。部分肝切除术、肝移植、射频消融术(RFA)和经导管动脉化疗栓塞(TACE)对HCC的疗效有限，患者的生存率较低[13]。多年来，HCC的发生一直被认为是一个多阶段的过程，包括遗传和表观遗传学的变化以及外部微环境因素，最终导致肝细胞的恶性转化[14]。目前，由于缺乏理想的HCC诊断生物标志物，导致一旦确诊患者即为中晚期。并且手术后复发主要也是因为肝内转移和肝外转移引起的，这也是HCC患者预后不良的主要原因[15]。因此识别新的标志物对不能手术的患者的早期诊断和治疗至关重要。在这个实验研究中，本文通过查阅相关snoRNA与HCC研究的前沿文献资料中筛选出在HCC组织中表达上升的5条snoRNAs(SNORD52、SNORD17、SNORD126、SNORA42和SNORD105),探究其能否在血液中能够有显著的[16,17]表达差异。

SnoRNAs被认为是一类特征最好的ncRNAs。在脊椎动物中，除了少数由RNA聚合酶Ⅱ自主转录的snoRNAs外，大多数snoRNAs都编码在蛋白质编码或非编码基因的内含子中[15]。有研究表明，snoRNAs在多种类型的癌症中具有抑癌或致癌功能，并参与了许多生物癌症过程，包括细胞死亡、侵袭和转移的激活、血管生成和持续增殖信号[18]。关于snoRNAs与肿瘤发生或癌症进展之间的关系的数据不断积累，但它们在细胞转化中的功能机制尚不清楚[19]。有研究表明，许多snoRNAs是稳定的，可以在体液中检测到，包括癌症患者的血浆、血清和尿液[20]。其表达水平与亚型的诊断、预后和分类密切相关。鉴于这些特性，snoRNAs有可能成为癌症的生物标志物。在这个研究中，本文发现有3条snoRNA(SNORD52、SNORD17、SNORA42)在肝癌患者与健康人群外周血中的表达差异具有统计学意义(P<0.05)。并且其在区分健康人群和HCC患者是具有较好的诊断效能，提示血液snoRNA可以成为一种潜在的肝癌诊断分子标志物。

SNORD52是由snoRNA宿主基因32(SNHG32)的内含子编码的具有64个核苷酸的一类C/D snoRNA。到目前为止，SNORD52的功能在很大程度上是未知的[21]。LI等[16]首次提供了肝癌患者组织中的SNORD52表达失控的证据，表明SNORD52为upf1调控的snoRNA。同时在80个HCC组织和不同的HCC细胞系中均观察到SNORD52的表达上调，并于HCC患者的不良预后密切相关，证实SNORD52在肝癌中作为一种功能相关的snoRNA。另外，他们在机制上表明SNORD52通过与CDK1结合，增加其蛋白或磷酸化水平，从而促进HCC的发生。新发现的Upf1/SNORD52/CDK1信号通路参与了HCC的发生。SNORA42在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中高表达，并与患者预后不良相关。它在结直肠癌(CRC)中也有致癌作用，并已被确定为前列腺癌[6,7,8,9]的预后标志物。它在HCC中的作用在WANG等[17]的研究中被发现。SNORA42在HCC组织中表达上调，并与不良预后相关。此外，在HCC细胞系中敲除SNORA42可以抑制它们的增殖和迁移，而其异位表达的作用则相反。此外，SNORA42基因敲掉的HCC细胞在体内形成肿瘤的能力明显受损使得细胞周期阻滞在G0/G1期。KEGG富集分析进一步证实了SNORA42敲掉细胞中差异表达的基因在p53信号通路和细胞周期中富集。在机制上，SNORA42通过抑制p53信号通路，通过促进细胞周期过渡和防止细胞凋亡来发挥其致癌作用。SNORD17是一种C/D snoRNA,首次在小鼠中被发现，执行rRNA的2′-核糖甲基化的作用。LIANG等[22]研究发现SNORD17通过NPM1/mybbp1a介导的正反馈回路促进了HCC的进展。并且进一步研究以SNORD17为靶点的ASOs成功地抑制了小鼠异种移植模型中的肿瘤生长，这为控制顽固性HCC提供了一种潜在的策略。

本实验基于前沿研究在组织层面中已被证实具有HCC诊断和临床意义的snoRNA,进一步探究其在血清学诊断中的作用与意义。本实验通过结合临床资料信息以及qPCR检测5条snoRNA(SNORD52、SNORD17、SNORD126、SNORA42和SNORD105)在原发性肝癌患者和健康人群血液中的表达差异，证实了其中3条snoRNA(SNORD52、SNORD17、SNORA42)在HCC中的差异水平以及其诊断意义。结果表明，通过检测血液中SNORD52、SNORD17、SNORA42的水平变化，可以区分HCC和健康人群并且提示诊断肝癌。另外，ROC曲线分析提示3条snoRNA均有良好的诊断准确率。同时，患者进行“腹腔镜下肝段切除术”术后7 d,SNORD52、SNORA42表达量下降，SNORD17表达量较术前比较，差异无统计学意义(P>0.05),进一步说明SNORD52、SNORA42与原发性肝癌有着密切关系。由于原发性HCC患者中SNORD17表达量低，术后SNORD17表达量变化不明显，所以导致术前术后改变不明显，但可用于原发性肝癌筛查。AFP已经普遍用于临床筛查HCC,但AFP升高并非局限于HCC,许多肝脏疾病(慢性活动性肝炎、肝硬化等)以及其他部位肿瘤也会导致AFP升高。同时，并非所有的原发性HCC都会导致AFP升高，大约30%的原发性HCC患者AFP为阴性，本研究中发现AFP阴性的原发性肝HCC患者中SNORD52、SNORD17、SNORA42差异也具有统计学意义，可以提示或者诊断原发性HCC,所以snoRNA具有较高的诊断价值。结合snoRNA高丰度，高保守、稳定性和血液样本易获取的优点，将AFP与外周血中的SNORD52、SNORD17、SNORA42进行联合检测，能够提高HCC的检出率，对诊断HCC可能具有更突出、更高的临床价值与应用。

基金资助:大学人才库培养(XZ-2019-505-017);

文章来源:陈志国,盛静,赵著洋,等.外周血snoRNA单一及组合panel对原发性肝癌的诊断价值[J].国际检验医学杂志,2024,45(10):1267-1272.