宫颈癌是全球女性第四大癌症，每年约57万女性被确诊[1]。早期宫颈癌通常进行手术和/或放射治疗，预后良好。近年来报道指出，含顺铂的同步放化疗治疗晚期宫颈癌具有明显的优越性，基于此，化疗药物顺铂逐渐成为宫颈癌化疗的标准[2]。然而化学抗性或耐药抗性是宫颈癌治疗的主要障碍。因此，对于宫颈癌化疗耐药机制的研究，以及如何实现耐药逆转、提高对化疗药物的敏感性一直是近几年研究的热点。 最近许多研究 表明，microRNA(miRNAs)可以调节宫颈癌的发生、侵袭、血管生成、免疫逃避和耐药性，在决定癌细胞对顺铂的耐药性中发挥着关键作用[3]。报道显示，miR-34a-5p异常表达并参与抑制肿瘤和细胞增殖转移的过程[4]。在神经管细胞瘤、膀胱癌、卵巢癌细胞中上调miR-34a-5p可以增加顺铂敏感性[5]。但对于宫颈癌中miR-34a-5p是否参与调控癌细胞对顺铂敏感性及其分子机制目前鲜有报道。Janus激酶(janus kinase, JAK)/信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路在免疫应答、细胞增殖、分化和存活中起着核心作用。JAK/STAT通路成分的过表达和过激活与不同类型癌症的发生发展有关，其中之一是宫颈癌[6]。因此本研究基于Hela细胞，通过过表达 miR-34a-5p, 探讨miR-34a-5p对宫颈癌细胞顺铂敏感性的影响及其与JAK/STAT3信号通路的关系，为宫颈癌的顺铂化疗治疗提供一定的参考依据。

1、材料与方法

1.1 材料

Hela细胞(货号：CL-0101)购自Procell; MEM(货号：c11095500bt)、Opti-MEM(货号：31985-062)购自Gibco公司；顺铂(货号：HY-17394)购自MCE;0.25%胰蛋白酶(货号：T1350)、CCK8(货号：CA1210)、RIPA(强)组织细胞快速裂解液(货号：R0010)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：PC0020)、结晶紫(货号：C8470)购自solarbio公司；Trizol(货号：15596026)购自ambion; SYBR FAST qPCR Master Mix(货号：KM4101)购自KAPA Biosystems; PCR引物购自武汉天一华煜基因科技有限公司；Lipofectamine®RNAiMAX(货号13778030)购自Invitrogen公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒(货号：556547)、Matrigel胶(货号：354230)购自BD公司；兔抗MDM4、STAT3、Anti-STAT3、MRP1、Bax、BCL2、GAPDH(货号分别为：PAB40349、PAB46077、ab76315、PAB37343、PAB 46088、PAB30041、PAB36269),Goat anti-Rabbit IgG抗体(货号：SAB43714)购自武汉贝茵莱生物科技有限公司。

1.2 仪器

CO2恒温培养箱(Thermo公司);DMIL LED倒置荧光显微镜(Leica公司);MK3酶标仪(芬兰雷勃);iCEN-24R高速冷冻离心机(杭州奥盛仪器有限公司);流式细胞仪[艾森生物(杭州)有限公司];Tanon-5200全自动化学发光分析仪(上海天能科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 不同剂量顺铂处理Hela细胞

Hela细胞于MEM(含NEAA)+10%FBS+1%P/S培养基中 培养，培养箱条件为 37 ℃、5%CO2,1∶2传代培养。将细胞按照0、1、2、4、8 μg/mL不同浓度顺铂处理 24 h[7]后，qRT-PCR检测miR-34a-5p的表达，CCK8法检测细胞活力。

1.3.2 miR-34a-5p mimic/NC转染及验证根据miR-34a-5p的序列(UGGCAGUGUCUU

AGCUGGUUGU)合成miR-34a-5p mimic/mimic NC,用Opti-MEM稀释质粒载体和 Lipofectamine®RNAiMAX,并混匀二者，转染6 h, 继续在培养箱中培养48 h, 然后用qRT-PCR检测miR-34a-5p的表达水平。

1.3.3 细胞分组及干预

将细胞分成以下5组：Blank组：Hela细胞不进行其他处理，作为空白对照；NC组：Hela细胞转染mimic NC并同时用等剂量PBS处理，作为双阴性对照；miR-34a-5p组：Hela细胞转染miR-34a-5p mimic并同时用等剂量的PBS处理；AG490组：Hela细胞转染mimic NC并同时用10 μmol/L的AG490处理；miR-34a-5p+AG490组：Hela细胞转染miR-34a-5p mimic并同时用10 μmol/L的AG490处理。

1.3.4 CCK8检测细胞活力

将细胞以3×103个细胞/孔培养于96孔板中，培养过夜，使细胞贴壁；按照不同分组处理细胞并培养24 h; 10 μL/孔加入CCK8溶液培养4 h; 在酶标仪波长450 nm处检测光密度值。

1.3.5 qRT-PCR检测基因表达水平

收集处理后的细胞，TRIzol试剂提取RNA,反转录获得 cDNA,qRT-PCR检测细胞中miR-34a-5p基因表达水平。 扩增程序如 下：95 ℃ 3 min; 95 ℃ 5 s, 56 ℃ 10 s, 72 ℃ 25 s, 40个循环。以U6为内参基因，引物序列为miR-34a-5p-F:GGGTGGCAGTGTCTTAG,miR-34a-5p-R:AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC;U6-F:CTCGCTTCGGCAGCACA,U6-R:AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.3.6 流式细胞术检测细胞凋亡

收集处理后的细胞400×g、4 ℃离心5 min, 弃上清，加入PBS再次离心，将沉淀重悬于200 μL PBS中，加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI,混匀后避光孵育30 min, 加入300 μL PBS,进行流式检测，NovoExpress软件分析。

1.3.7 Transwell实验检测侵袭细胞数

采用涂有Matrigel胶的Transwell小室检测癌细胞的侵袭性。在上室中加入0.5 mL的1×105细胞/mL,下室加入0.75 mL的10% FBS培养基。孵育24 h后，用甲醇固定小室底部20 min, 结晶紫染色。最后，在显微镜下对入侵细胞进行拍照和计数。

1.3.8 Western blot检测蛋白表达水平

使用Western blot检测miR-34a-5p下游靶基因和通路蛋白MDM4、STAT3、p-STAT3,顺铂耐药蛋白MRP1,凋亡蛋白Bax、BCL-2表达水平。收集细胞，裂解后进行蛋白定量，制作12%的分离胶和5%的浓缩胶，每孔上样20 μg蛋白；浓缩胶80 V 40 min, 分离胶120 V 50 min进行电泳，湿转转膜；5%脱脂奶粉室温封闭，4 ℃过夜，1∶1 000稀释的一抗孵育1 h, 1∶20 000稀释的二抗孵育1 h; ECL发光检测，TANON GIS软件读取条带灰度值。

1.4 统计学分析

本实验数据以均值±标准差表示，SPSS 19.0软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，GraphPad Prism 8.0软件作图，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 miR-34a在宫颈癌临床样本中的表达

如图1所示，通过GEO数据库获取GSE19611数据集共43个样本miRNA表达谱，从中选择治疗前鳞状细胞宫颈癌和正常宫颈样本的miRNA表达谱进行差异分析，以|log2FC|>0.3且P value≤0.3为阈值，筛选到27个miRNA在宫颈癌样本中显著下调，13个miRNA在宫颈癌样本中显著上调。结果表明，在宫颈癌中miR-34a表达显著下调。

图1 宫颈癌临床样本miRNA表达谱差异分析火山图

2.2 不同剂量顺铂处理后对细胞活力及 miR-34a-5p表达的影响

如图2所示，随着顺铂处理剂量的增加，细胞活力和miR-34a-5p表达均显著下降(P<0.05);且用6 μg/mL以下的顺铂干预时，细胞活力和miR-34a-5p表达均表现出剂量依赖性。

图2 顺铂影响Hela细胞增殖活力和miR-34a-5p表达

2.3 过表达miR-34a-5p对细胞顺铂敏感性的影响

如图3A所示，过表达miR-34a-5p后其表达水平显著上升(P<0.05),表示转染成功。如图3B所示，相比Blank/NC组，miR-34a-5p/AG490组miR-34a-5p 表达显著上升 (P<0.05);相比miR-34a-5p/AG490组，miR-34a-5p+AG490组miR-34a-5p表达显著上升(P<0.05)。

图3 不同处理对Hela细胞中miR-34a-5p表达的影响

2.4 过表达miR -34a-5p对细胞增殖和凋亡的影响

如图4所示，与Blank/NC组相比，miR-34a-5p/AG490组细胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax表达显著上升(P<0.05),细胞增殖能力和BCL-2蛋白表达显著下降(P<0.05);与miR-34a-5p/AG490组相比，miR-34a-5p+AG490组细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著上升(P<0.05),细胞增殖能力和BCL-2蛋白表达显著下降(P<0.05)。

2.5 过表达miR-34a-5p对细胞侵袭的影响

如图5所示，与Blank/NC组相比，miR-34a-5p/AG490组细胞侵袭数量显著下降(P<0.05);与miR-34a-5p/AG490组相比，miR-34a-5p+AG490组细胞侵袭数量显著下降(P<0.05)。

2.6 过表达miR-34a-5p对STAT3磷酸化的影响

如图6所示，与Blank/NC组相比，miR-34a-5p/AG490组细胞MDM4蛋白和p-STAT3/STAT3水平显著下降(P<0.05);与miR-34a-5p/AG490组相比，miR-34a-5p+AG490组细胞MDM4蛋白和p-STAT3/STAT3水平显著下降(P<0.05)。

2.7 过表达miR-34a-5p对宫颈癌细胞耐药的影响

如图7所示，使用不同浓度顺铂处理各组细胞，与Blank/NC组相比，miR-34a-5p/AG490组细胞活力显著下降(P<0.05),且呈剂量依赖性； 与miR-34a-5p/AG490组相比，miR-34a-5p+AG490组细胞活力显著下降(P<0.05),且呈剂量依赖性。此外，与Blank/NC组相比，miR-34a-5p/AG490组MRP1蛋白表达显著下降(P<0.05);与miR-34a-5p/AG490组相比，miR-34a-5p+AG490组MRP1蛋白表达显著下降(P<0.05)。

图4 miR-34a-5p表达水平对Hela细胞生物学行为的影响

图5 Transwell实验检测侵袭细胞数(结晶紫染色×200)

图6 Western blot检测MDM4、p-STAT3、STAT3的蛋白表达

图7 miR-34a-5p表达水平对Hela细胞耐药的影响

3、讨论

宫颈癌是全球范围内主要的恶性肿瘤之一，晚期患者预后差，死亡率高，其5年生存率仅10%～20%[8]。GLOBOCAN数据库显示2020年宫颈癌新增病例占所有部位癌发病率的3.1%,因宫颈癌死亡率占所有部位癌死亡率的3.4%[9]。化疗是通过特异性靶向和破坏肿瘤细胞的DNA,抑制肿瘤细胞的发育和增殖。但由于基因和表观遗传的改变，药物外排增加，药物积累减少，对抗癌药物的耐药性成为癌症治疗的主要挑战[10,11]。

研究人员发现miR-34a-5p是一种很有前途的癌症预测标志物，可以抑制癌细胞的繁殖发育，抑制肿瘤生长。食管鳞状细胞癌的组织和细胞系中，miR-34a-5p表达下调，其过表达可抑制食管鳞状细胞癌的增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化[12]。WANG等人[12]发现miR-34a在宫颈癌患者中的水平明显低于健康对照者血清中的水平，可作为宫颈癌诊断和预后的生物标志物，具有高灵敏度和特异性[13]。本研究通过GEO数据分析，发现宫颈癌临床样本中miR-34a表达下调，这验证了miR-34a的差异表达对宫颈癌的发生发展具有重要作用。此外，miR-34a-5p在调节癌细胞对化疗药物的化学敏感性中的作用也被证明。过表达miR-34a-5p在一定程度上可以抑制非小细胞肺癌、骨肉瘤等多种癌症的化疗药物耐药性[14,15]。在顺铂耐药的卵巢癌细胞系中miR-34a-5p的表达降低，上调 miR-34a-5p的表达能够靶向负性程序性细胞死亡1配体1的表达，体内上调时还能减弱用顺铂处理的裸鼠对顺铂耐药卵巢癌细胞的致瘤性[16]。然而，miR-34a-5p在宫颈癌细胞对顺铂的化疗药物敏感性中发挥的作用和机制尚不清楚。因此，本研究针对这一困惑进行了实验，结果显示，顺铂干预Hela细胞后，Hela细胞的增殖活力和miR-34a-5p的表达均呈下降趋势，且与顺铂作用浓度负相关，这提示miR-34a-5p可能在宫颈癌的发展和对顺铂敏感性中具有重要作用。为进一步证实，本研究对细胞增殖活力、侵袭程度、凋亡率及相关因子进行检测，结果显示上调miR-34a-5p表达抑制Hela细胞增殖、侵袭和抗凋亡蛋白BCL-2表达，提高Hela细胞的凋亡和促凋亡蛋白Bax表达。这提示miR-34a-5p对宫颈癌的发展有抑制作用。

顺铂作为一种能有效治疗晚期/复发性宫颈癌的化疗药物，总缓解率达30%[17]。顺铂介导的抗癌作用与多种信号通路有关，如JAK/STAT信号通路的激活可促进肿瘤细胞对顺铂的耐药性[18,19]。STAT蛋白是JAK下游的信号分子，一旦JAK-STAT信号传导失调，JAK就会启动受体的酪氨酸磷酸化并招募相应的STAT。STAT被激活后呈磷酸化表达，会诱导同二聚体化，进而导致核易位、DNA结合和随后的基因转录，这一过程能够将外部信号快速传输到细胞核以调节生物和病理过程，促进癌症进展[20,21]。在STAT家族中，STAT3被认为在从质膜到细胞核的信号传递中发挥着核心作用，使其成为药物开发的一个有前景的靶标[22]。因此，抑制STAT3的激活在预防和治疗癌症方面具有巨大潜力，可提高肿瘤细胞对顺铂的化学敏感性[23]。本研究采用JAK/STAT通路抑制剂AG490处理Hela细胞，结果显示AG490处理可提高Hela细胞中miR-34a-5p的表达，抑制细胞侵袭，减少耐药蛋白MRP1的表达，提高癌细胞凋亡率，增加Bax表达，减少BCL-2表达。且在miR-34a-5p mimic诱导的细胞中添加AG490可进一步加强miR-34a-5p的作用，这提示STAT3磷酸化可能参与miR-34a-5p在Hela细胞中发挥的促顺铂敏感性作用。

本课题组前期研究确定了鼠双微体4(mouse double minute 4,MDM4)在临床肿瘤预测方面的潜力，发现miR-34a-5p通过靶向MDM4增加宫颈癌细胞对奥沙利铂化疗的敏感性[24]。因此，本研究推测miR-34a-5p可通过靶向MDM4增加宫颈癌细胞对顺铂化疗的敏感性。MDM4是一种癌蛋白，在癌症中经常被扩增和上调，通过阻断p53通路下游靶基因的表达来促进肿瘤生长和细胞凋亡抑制，作为致癌基因发挥作用[25]。本研究发现，miR-34a-5p mimic和AG490处理均可降低Hela细胞中MDM4的蛋白表达，而同时使用miR-34a-5p mimic及AG490处理则可进一步降低MDM4的蛋白表达，提示MDM4参与miR-34a-5p在Hela细胞中发挥的促顺铂敏感性作用。

综上所述，miR-34a-5p可增加宫颈癌细胞对顺铂化疗的敏感性，其机制可能与MDM4/JAK/STAT3信号通路相关，这为临床上宫颈癌的顺铂化疗治疗提供一定的理论依据。

参考文献:

[18]朱素丽,陈运昊,姚尖平,等.肉桂醛调控CD44s/STAT3信号通路抑制胰腺癌细胞增殖和肿瘤细胞干性[J].中国药理学通报,2022,38(05):676-683.

[19]毛万丽,李杰慧,冉立.宫颈癌顺铂耐药研究进展[J].现代肿瘤医学,2021,29(16):2927-2932.

[21] 谷蕾,张丽军,刘立芳,等.JAK/STAT信号通路抑制剂与肺癌 JAK/STAT信号通路抑制剂与肺癌[J].现代肿瘤医学,2018,26(02):314-317.

基金资助:湖北省科技厅科技创新项目(编号:2021CFB576);

文章来源:贾奕娟,刘丽丹,龚世雄,等.miR-34a-5p提高顺铂在宫颈癌细胞中的敏感性及其可能机制[J].现代肿瘤医学,2024,32(15):2688-2694.