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叉头框蛋白P3在宫颈鳞癌中表达及与细胞增殖凋亡指标关系

2024-08-13 68 上传者：管理员

摘要：目的探究叉头框蛋白P3（FOXP3）在子宫颈鳞癌中的表达，探讨其临床意义，分析其与细胞增殖和凋亡指标的关系。方法选取2016年2月—2017年5月在锦州医科大学附属第一医院确诊为子宫颈鳞癌并行根治手术治疗的55例患者作为研究对象，留取术后肿瘤组织；另收集同期在该院因子宫肌瘤行子宫全切后留取的正常子宫颈组织55例作为对照，应用免疫组化法检测FOXP3、增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki-67、Bcl-2相关X蛋白（BAX）及Caspase-3的表达。结果子宫颈鳞癌肿瘤细胞中FOXP3表达阳性率（58.18%）明显高于子宫颈上皮组织（16.36%）,差异均有统计学意义（χ2=20.571 2,均P<0.05）。FOXP3在不同病理分型、有无淋巴结转移及肿瘤是否限于子宫体的表达中差异均有统计学意义（均P<0.05）。子宫颈鳞癌中FOXP3与PCNA、FOXP3及Ki-67均呈正相关关系（均P<0.05）,FOXP3与BAX、FOXP3及Caspase-3均呈负相关关系（均P<0.05）。生存分析显示FOXP3与生存时间相关（P<0.05）。结论 FOXP3在子宫颈鳞癌肿瘤细胞中高表达，与细胞增殖和凋亡指标具有相关性，FOXP3可能为子宫颈鳞癌独立的预后因子。

关键词：
凋亡
叉头框蛋白P3
增殖
子宫颈鳞癌
预后
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子宫颈鳞癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，起源于宫颈鳞状上皮和柱状上皮的交界区[1],与人乳头瘤病毒(HPV)感染相关，上皮内瘤变为前驱病变[2],病变形成后肿瘤细胞呈高增殖状态，具有侵袭和进展的生物学特征，总体预后较差[3-4],其发病过程复杂，目前学者在基因水平上关注其发生的机制，并发现在肿瘤形成过程中存在多种基因异常表达。叉头框蛋白P3(FOXP3)是叉头框蛋白家族中的重要成员，近年学者认识到其在肿瘤间质的淋巴细胞中异常表达，可能是肿瘤细胞微环境中的调控因子，但是学者在研究[5-6]中发现肿瘤性的上皮细胞中也伴随着FOXP3的异常，认为其在肿瘤细胞形成和恶性转化过程中具有重要作用。本研究基于子宫颈鳞癌进行前瞻性实验设计，检测FOXP3在肿瘤细胞中的表达特征，探讨其在不同临床病理特征中的表达差异，分析其与细胞增殖指标和凋亡指标的关系，探讨其预后价值。

1、资料与方法

1.1资料来源

选取2016年2月—2017年5月在锦州医科大学附属第一医院确诊为子宫颈鳞癌并行根治手术治疗的55例患者作为研究对象。纳入标准：①首次发病并行手术治疗，临床资料完整；②术后均行病理学检查，研究前均经2位病理主治医师复核并再次明确，符合WHO中的诊断标准和分型。排除标准：①术前行放、化疗；②双原发癌；③有严重内科系统疾病或免疫性疾病；④近3个月有感染史。另选择同期在本院因子宫肌瘤行子宫全切后留取的55例正常子宫颈组织作为对照，纳入和排除标准同上。均留取术后石蜡包埋组织，本研究经锦州医科大学附属第一医院伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》中的要求。样本量纳入应用统计学公式n1=n2=2[(uα+uβ)/δ/σ]2+1/4uα2估算，结合预实验和查阅文献中的数据，拟正常子宫颈上皮细胞中FOXP3阳性率10%,子宫颈鳞癌肿瘤细胞中阳性率为50%,拟σ=10,δ/σ=0.59,α取0.05,得到n1=n2≈52例，拟定5%删失值(失访或非全因死亡),因此子宫颈鳞癌患者和对照患者术后组织纳入样本量均为55例。

1.2方法

基于术后蜡包埋组织进行实验。FOXP3、增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki-67、Bcl-2相关X蛋白(BAX)及Caspase-3的一抗均为浓缩液，购自武汉博士德公司，先行预实验选择显色效果最清晰且对比度最好的稀释浓度进行正式实验。稀释浓度：FOXP3为1∶200、PCNA为1∶150,Ki-67为1∶200、BAX为1∶100、Caspase-3为1∶200。应用免疫组化EnVision法完成实验，严格按说明书操作，DAB显色，减少误差。实验结果均由2名病理主治医师盲法阅片进行判读。每张切片先在100倍(低倍)镜下观察并选择上皮细胞集中且显色效果最好的3个区域，然后在200倍(高倍)镜下计数并观察，取平均值。FOXP3、PCNA及Ki-67均以细胞核显示为黄色、棕黄及棕褐色为阳性，BAX、Caspase-3均以细胞质显示为黄色、棕黄及棕褐色为阳性。以二维法评分，着色强度评分：以无、黄色、棕黄、棕褐色分别计为0、1、2、3分，阳性细胞百分率评分：以<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别计为0、1、2、3、4分；两者相乘为每张切片的最终评分，分值范围为0～12分。以≤5分为阴性，以>5分为阳性，计算阳性率。

1.3统计学分析

应用SAS 6.12统计分析软件进行统计学处理数据，组间率的比较应用χ2检验，相关性应用相关回归分析，计算回归方程，并对随访资料应用Kaplan-Meier行生存分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1患者基线资料

子宫颈鳞癌共观察55例，年龄31～85岁，中位年龄56岁。其中非角化型41例，角化型14例；有淋巴结转移18例，无淋巴结转移37例；有脉管癌栓12例，无脉管癌栓43例。因子宫肌瘤行子宫全切后的患者共55例，年龄37～81岁，中位年龄59岁，均留取正常子宫颈组织。病理HE图像见图1。

2.2生信分析结果

生物信息分析(GEPIA网站)预测FOXP3在子宫颈鳞癌中的表达可能高于正常组织。

2.3子宫颈鳞癌和正常子宫颈组织中FOXP3阳性率比较

子宫颈鳞癌中FOXP3的阳性率明显高于正常子宫颈组织，差异有统计学意义(χ2=20.571 2,P<0.05)。子宫颈鳞癌和正常子宫颈组织中FOXP3阳性率比较见表1,FOXP3的表达见图2。

2.4 FOXP3在子宫颈鳞癌不同临床病理特征分组中表达的比较

FOXP3在子宫颈鳞癌不同病理分型、有无淋巴结转移及肿瘤是否限于子宫体的表达中差异均有统计学意义(均P<0.05);而在不同年龄、有无坏死及有无脉管癌栓的表达中差异均无统计学意义(均P>0.05)。FOXP3在子宫颈鳞癌不同临床病理特征分组中表达的比较见表2。

2.5子宫颈鳞癌中FOXP3与增殖指标PCNA和Ki-67的相关性

免疫组化检测子宫颈鳞癌中PCNA评分范围是1～10分，Ki-67评分范围是1～12分。相关回归分析显示，FOXP3与PCNA(回归方程为Y=0.619X+2.084)、FOXP3与Ki-67(回归方程为Y=0.568X+1.917)均呈正相关性(均P<0.05)。PCNA和Ki-67在子宫颈鳞癌中的表达见图3。

2.6子宫颈鳞癌中FOXP3与凋亡指标BAX和Caspase-3的相关性

免疫组化检测子宫颈鳞癌中BAX评分范围是2～12分，Caspase-3评分范围是1～12分。相关回归分析显示FOXP3与BAX(回归方程为Y=-0.318X+7.143)、FOXP3与Caspase-3(回归方程为Y=-0.346X+7.333)均呈负关性(均P<0.05)。BAX和Caspase-3在子宫颈鳞癌中的表达见图4。

图1正常子宫颈组织和子宫颈鳞癌病理图像(HE染色)

表1子宫颈鳞癌和正常子宫颈组织中FOXP3阳性率比较

2.7生存分析

对纳入患者进行术后5年(60个月)随访，截止时间2022年5月31日。术后60个月时点共33例死亡，存活20例，失访2例。术后生存时间范围为11～60个月，中位术后生存时间为42个月。生存分析显示FOXP3与生存时间有关(FOXP3的临界值为5分，χ2=5.725 1,P<0.05)。COX单因素分析中均发现FOXP3是影响患者预后的独立危险因素，即检测组织FOXP3的表达对判断子宫颈鳞癌的预后有价值。单因素分析结果见表3。FOXP3表达的生存分析图见图5。

图2 FOXP3的表达(免疫组化En Vision法)

表2FOXP3在子宫颈鳞癌不同临床病理特征分组中表达的比较[例(%)]

图3 PCNA和Ki-67在子宫颈鳞癌中的表达(免疫组化En Vision法)

图4 BAX和Caspase-3在子宫颈鳞癌中的表达(免疫组化En Vision法)

表3单因素分析结果

3、讨论

FOXP3作为精确调控调节性T细胞的重要因子，其基因定位于X染色体的p臂上Xp.11.23,有11个编码基因的外显子(E2～E12)和1个非编码基因的外显子(E1),FOXP3表达的蛋白含有431个氨基酸，分子量为47.25Da[7-8],参与调控约700个基因的转录。近年研究[9-10]显示其在上皮细胞恶性转化和恶变的上皮细胞中有表达。在子宫颈鳞癌的癌前病变的研究[11]中发现，FOXP3的表达可维持宿主免疫抑制状态，有利于HPV感染的持续性和鳞状上皮内病变的出现。FOXP3可以作为宫颈上皮内瘤变(尤其是宫颈上皮内瘤变Ⅱ级患者)进展和消退的独立预测因子[12]。

本研究结果显示，子宫颈鳞癌中FOXP3的阳性率明显高于子宫颈组织，且在不同病理分型、有无淋巴结转移及肿瘤是否限于子宫体的表达中差异有统计学意义，提示POXP3在肿瘤细胞中高表达对子宫颈鳞癌形成和进展具有促进作用。FOXP3的作用与介导Wnt/β-catenin信号通路有关，Yang等[13]在非小细胞肺癌中研究发现FOXP3能通过活化Wnt/β-catenin信号通路促进肿瘤生长和转移，也有学者[14]发现此种作用对肿瘤间质T细胞的功能具有一定作用，可能是肿瘤实质与间质共同作用的结果。FOXP3在肿瘤细胞微环境中的表达升高可以抑制干细胞向成熟细胞转化，而分化差的细胞为幼稚细胞，表现为“永生化”的特征，此类细胞体积小，细胞核深染，细胞间连接明显松散，易于迁移和播散[15-16]。FOXP3能促进肿瘤的侵袭和迁移，这也使其具有广泛的生物学特性[17-18]。本研究结果显示，FOXP3与增殖指标PCNA和Ki-67具有正相关性，与凋亡指标BAX和Caspase-3具有负相关性，提示POXP3在对子宫颈鳞癌的作用可能是通过调控细胞增殖和凋亡实现的。BAX和Caspase-3均为促进凋亡的基因[19],FOXP3可能是通过抑制2个凋亡的核心因子减少肿瘤细胞的程序性死亡，即使肿瘤细胞具有“永生化”。Caspase-3最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP,该酶与DNA修复、基因完整性监护有关，在细胞凋亡启动时，PARP在Asp216-Gly217之间被剪切成31kD和85kD 2个片段，使2个锌指结构与羧基端催化区域分离，正常功能受阻。有研究[20]显示，miR-149-3p通过靶向FOXP3抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、侵袭及迁移，同时促进细胞凋亡，因此POXP3的作用方式和特征可能更多。但POXP3对凋亡的调控作用还需要进行体外细胞株实验进行直接验证。本研究结果显示，FOXP3与生存时间相关，且经回归分析显示FOXP3是预测子宫颈鳞癌的独立危险因素，提示检测肿瘤细胞中FOXP3的表达对判断预后具有重要意义。近年学者[21]发现子宫颈鳞癌患者血清中FOXP3有表达，发现血液中与组织中FOXP3的表达具有一致性，FOXP3的表达具有从量变到质变的特征，认为FOXP3既可作为宫颈癌的筛查、术前疾病评估及术后随访的辅助指标，也可为临床靶向干预提供理论依据。

综上所述，FOXP3在子宫颈鳞癌细胞中高表达，与细胞增殖指标和凋亡指标相关，FOXP3为子宫颈鳞癌的独立预后因子。

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文章来源:刘岩,黄鑫,王雨艳,等.叉头框蛋白P3在子宫颈鳞癌中的表达及与细胞增殖和凋亡指标的关系[J].中国妇幼保健,2024,39(16):3148-3152.