本研究利用课题组前期构建的羊驼天然纳米抗体文库，通过噬菌体文库展示技术对多房棘球蚴亮氨酸氨基肽酶（Em-LAP）进行筛选，获得抗纳米抗体并表达纯化。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

羊驼天然纳米抗体文库和M13辅助噬菌体、大肠杆菌XL1-Blue及用辣根过氧化物酶（HRP）标记的M13二抗均购自艾柏森（北京）生物科技有限公司；pET30a、大肠杆菌BL21(DE3）购自南京钟鼎生物技术有限公司。

Wash Buffer、Elution Buffer、Tris Buffer均购自艾柏森（北京）生物科技有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，批号：No.103J051）和氨苄青霉素钠（Amp，批号：No.3230904001）、盐酸四环素（TC，批号：No.4221213001）购自索莱宝（北京）科技有限公司；卡那霉素（Kana）购自BBI（上海）生命科学有限公司（批号：B309BA0006）；葡萄糖（GLu）购自辰欣药业股份有限公司（批号：D22120632);NiNTD亲和层析柱购自美国金斯瑞生物科技公司（批号：C40732206）；透析袋购自索莱宝（北京）科技有限公司（批号：No.224D021）。

1.1.2 主要仪器

培养箱购自THERMO公司；多功能酶标仪购自TECAN公司；低温冷冻离心机购自SIGMA公司；电脑核酸蛋白检测仪购自上海嘉鹏科技有限公司；凝胶成像分析系统购自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 抗Em-LAP纳米抗体的文库筛选

利用课题组前期构建的羊驼天然纳米抗体文库进行3轮固相亲和筛选：将Em-LAP用ELISA包被液稀释（10μg/mL）后加入酶标板孔孵育（4℃，过夜），弃包被液，洗完酶标板后在吸水纸上轻轻拍干（2次），封闭（3%牛奶，37℃，1 h），弃封闭液，洗完酶标板后在吸水纸上轻轻拍干（2次），将噬菌体文库加入酶标板孔孵育（37℃，1.5 h～2.0 h）；洗去未结合的游离噬菌体后洗脱与靶蛋白Em-LAP结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主菌XL1-Blue后置摇床振摇（37℃，30 min），取50μL混合液涂布于2YT+Amp+TC+Glu固体培养基；在培养液中分别加入辅助噬菌体和2YT+Amp+TC+Glu培养基静置孵育（37℃，30 min）后放入摇床振摇（37℃，1 h）；离心（室温，6 000 r/min,10 min），弃上清液，加入2YT+Amp+TC+Kana培养基重悬沉淀物；将离心管放入（斜插）摇床振摇（30℃，过夜），离心（4℃，11 000 r/min,5 min），取上清液用于下一轮筛选，经过3轮筛选，分离出高特异性抗Em-LAP的纳米抗体。

1.2.2 抗Em-LAP纳米抗体单克隆的亲和力检测

用phage-ELISA法检测抗Em-LAP纳米抗体单克隆的亲和性。从第3轮培养的固体培养平板上随机挑选多个单克隆置加有2YT+Amp+TC+Glu培养基的离心管中振摇（37℃，6 h～8 h），加入辅助噬菌体静置孵育（37℃，30 min），然后放入摇床振摇1 h后离心（室温，6 000 r/min,10 min），弃上清液，使用2YT+Amp+TC+Kana培养基重悬沉淀物后置摇床振摇（37℃，过夜），离心（4℃，11 000 r/min,5 min），取上清液。将Em-LAP用ELISA包被液稀释（10μg/mL）后加入酶标板孔。同样处理BSA作为阴性对照品（NC），包被（4℃，过夜），次日弃包被液，洗完酶标板后在吸水纸上轻轻拍干（2次），封闭（3%牛奶，37℃，1.5 h），弃封闭液，洗完酶标板后在吸水纸上轻轻拍干（2次）。将前述上清液做梯度稀释后分别加入酶标板孔孵育（37℃，1.5 h）；弃一抗，洗完酶标板后在吸水纸上轻轻拍干（3次），加入M13二抗（1∶1000）孵育（37℃，40 min）；弃二抗，洗完酶标板后在吸水纸上轻轻拍干（3次），加入TMB显色液孵育（37℃，避光，10min），加入ELISA终止液终止反应。使用多功能酶标仪于450 nm处读取吸光度（OD）值，OD值大于0.5的为阳性克隆子，将阳性克隆子送至生工生物公司测序。

1.2.3 LAPNb在质粒pET30a中的构建及表达鉴定

将测得的序列经翻译后得到氨基酸序列，经多序列对比分析后，去除相同序列，选出目的序列，将目的序列连接柔性序列后串联；利用AlphaFold软件预测氨基酸序列三维结构，然后利用ZDOCK软件预测与靶蛋白对接的情况，得到最终序列；经密码子优化后克隆至表达载体pET30a，转入BL21(DE3）感受态细胞并涂布于TB+Kana固体平板，挑取培养的阳性单克隆子，用酶切法验证克隆结果。

挑取成功转化的单克隆子接种于TB+Kana液体培养基培养6 h～8 h，吸取上述培养菌液至加有TB+Kana液体培养基的摇床振摇（37℃，3 h～4 h），加入IPTG诱导（过夜）；分别取诱导前菌液和诱导后菌液各1 mL，加入适量上样缓冲液，经SDS-PAGE电泳后进行考马斯亮兰染色确认诱导表达结果。

1.2.4 pET30a-LAPNb融合蛋白的纯化分析

将上述诱导菌液离心（4℃，10 000 r/min,3 min）后弃上清液，加入Binding Buffer(50 mM NaH2PO4,10 mM Tris HCl）重悬菌体沉淀物后离心（4℃，10 000 r/min,3 min），弃上清液，此步骤重复三次；对重悬液做超声破碎，离心（室温，10 000r/min,15 min），弃上清液，加入含8 M尿素的Binding Buffer溶解沉淀物，继续做超声破碎直至沉淀物溶解；将超声破碎所得溶液加入透析袋，放入复性缓冲液做蛋白复性后，进行金属螯合亲和层析纯化：加入Binding Buffer预平衡Ni柱至OD280到达基线；将复性后的蛋白从透析袋取出，离心（4℃，10 000r/min,15 min），取上清液，加入Ni柱；用Wash Buffer冲洗Ni柱，直至流出液的OD280到达基线；用Elution Buffer(50 mM NaH2PO4,10 mM Tris HCl,250 mM Imidazole）洗脱目的蛋白并收集，取1 mL收集的流出液做SDS-PAGE电泳分析。

1.2.5 串联纳米抗体LAPNb 3-6-2与其靶抗原Em-LAP的亲和力的鉴定

方法同phage-ELISA法。所使用的一抗为不同稀释度的LAPNb 3-6-2纯化蛋白。

1.2.6 统计学分析

统计分析使用SPSS 27.0软件。数据以表示。多组间的比较采用单因素方差法分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 抗Em-LAP纳米抗体的筛选

以Em-LAP为靶抗原筛选纳米抗体。经过3轮“吸附—洗脱—富集”得到抗Em-LAP纳米抗体的噬菌体，噬菌体在固体培养平板上的富集情况如图1所示。

图1 噬菌体在固体培养平板上的富集图

随机取第3轮培养的单克隆噬菌体上清液，经phage-ELISA鉴定，使用多功能酶标仪于450 nm处读取吸光度（OD）值，选出OD450值大于0.5的克隆子用于后续实验。实验结果见表1。

表1 phage-ELISA结果  

2.2 纳米抗体的序列对比及与纳米抗体靶蛋白的对接分析

对单克隆纳米抗体进行测序后得到核苷酸序列，根据酶切位点找到目的核苷酸序列，将核苷酸序列翻译成氨基酸序列。纳米抗体序列见图2。用AlphaFold软件预测序列三维结构，利用ZDOCK软件预测与靶蛋白的对接情况，结果见图2。经过比对各纳米抗体与靶蛋白的结合情况，最终选择与靶蛋白结合时更加接近靶蛋白酶活性位点的LAPNb 3-6。

图2 纳米抗体序列对比及靶蛋白三维结构对接图

2.3 目的序列蛋白三维结构预测

使用AlphaFold软件预测目的蛋白三维结构。结果显示，抗LAP纳米抗体均包含较多的β折叠，红色所示部分为CDR1区，黄色所示部分为CDR2区，绿色所示部分为CDR3区，具体情形见图3。将两个纳米抗体以N端-柔性序列-N端/C端形式串联后，分别于序列的N端或C端添加His标签得到串联序列，使用AlphaFold软件预测串联序列三维结构，具体情形见图4。

图3 纳米抗体LAPNb 3-6的三维结构

图4 纳米抗体LAPNb 3-6串联序列的三维结构

2.4 目的蛋白与靶蛋白三维结构的对接

利用ZDOCK软件预测抗LAP纳米抗体与靶蛋白LAP的对接情况。LAPNb3-6蛋白与靶蛋白对接的情形见图5。LAPNb 3-6蛋白带负电的ASP112与LAP蛋白带正电的ARG457、HIS385形成盐桥相互作用，LAP蛋白的ARG457、TYR390、HIS459、SER425、ILE424氨基酸与LAPNb 3-6蛋白的ASP112、TYR113、GLY26氨基酸形成氢键相互作用。

在4个串联纳米抗体与靶蛋白的ZDOCK对接的3D模型中，因串联纳米抗体LAPNb 3-6-2(N端-柔性序列-N端+His标签）结合于靶蛋白EmLAP的酶活性中心，所以选用该序列用于后续实验。串联纳米抗体LAPNb 3-6-2序列的结构见图6。LAPNb 3-6-2蛋白与靶蛋白对接情况见图7,A和B分别为LAPNb 3-6-2蛋白与靶蛋白Em-LAP三维结构对接的卡通形式、表面形式，C和D分别为LAPNb 3-6-2蛋白与靶蛋白Em-LAP两个结合位点的结合构象。Em-LAP蛋白带负电的GLU334与LAPNb 3-6-2蛋白带正电的LYS116形成盐桥而相互作用；Em-LAP蛋白中的ARG87、ASN449、ASP333、ARG345、LEU388、ALA389、SER391、GLU423与LAPNb3-6-2蛋白中的GLU175、THR121、LEU119、GLY117、ARG176、GLN170、LYS240形成氢键而相互作用。

图5 LAPNb 3-6蛋白与靶蛋白对接图

图6 LAPNb 3-6-2的结构

图7 LAPNb 3-6-2蛋白与靶蛋白Em-LAP三维结构的结合图

2.5 pET30a-LAPNb的质粒构建及表达鉴定

目的串联序列选用Esherichia coil密码子表。进行密码子优化后的序列如下：CATATGCAAGTTCAGCTAGTAGAATCAGGTGGAG GGCTCGTGCAAAGCGGCGGTTCGCTGCGCTTATC CTGTGCGGCTAGCGGCTTCAGCCTGGACTACTTTG CGATCGGCTGGTTTCGTCAGGCACCGGGTAAAGA GAGAGAAGGTGTGTCTTGTATTTCATCCACCGAT GGCTCCACATATTACGAAGATTCTGTTAAAGGCC GTTTCACCATCAGCCGCGATAACGCACGTAATAC CGTCTATCTGCAAATGAATCGTCTTAAGCCGGAA GACACCGGTGTCTACTACTGCGCTGCTGCGACCG GGTGCAGCGATTACGTGGAAGTTAAGGGTATGGA TTACTGGGGTAAAGGCACCTTGGTCACCGTGTCG TCCGATCCGCGTGTTCCGTCGAGCCAGGTTCAGCT GGTGGAGAGCGGTGGTGGTCTGGTGCAGAGCGGT GGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCAGCGAGCGGTT TTTCTTTGGACTACTTCGCCATTGGTTGGTTCCGC CAAGCGCCAGGTAAAGAGCGCGAGGGTGTTAGC TGTATTAGTTCCACTGACGGCTCTACGTATTACGA GGACAGCGTTAAGGGCCGTTTTACGATCAGCCGT GACAACGCCCGTAACACCGTGTATCTGCAGATGA ACCGCCTGAAACCGGAAGATACCGGCGTGTACTA TTGCGCGGCGGCCACGGGCTGCAGCGACTATGTT GAGGTAAAGGGTATGGACTATTGGGGTAAGGGC ACCTTGGTGACCGTTAGCTCCCATCACCACCACC ATCATTAACTCGAG。优化后的序列引入NdeI/XhoI限制性内切酶位点连入pET30a载体做酶切鉴定，鉴定结果见图8A，图中5 Kbp处出现的条带显示结果与预期结果一致（798 bp），表明目的串联序列成功连入该质粒载体，构建pET30a-LAPNb 3-6-2重组质粒成功。

重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3）菌株，经扩大培养、诱导表达后，使用SDS-PAGE鉴定，诱导表达结果见图8B，诱导后在28 KD处可见目的条带。诱导后的破碎沉淀物中可见目的蛋白，而诱导后的破碎上清液中未见目的蛋白，故使用诱导后的破碎沉淀物做蛋白纯化。

图8 pET30a-LAPNb 3-6-2的质粒构建及表达鉴定图

2.6 pET30a-LAPNb 3-6-2融合蛋白的纯化分析

诱导破碎后的沉淀物经包涵体蛋白变性、复性后，加入Ni柱使用金属螯合亲和层析进行目的蛋白的纯化，结果显示使用Wash Buffer冲洗Ni柱结合的杂蛋白后，用Elution Buffer洗脱可以获得纯化目的蛋白，纯化鉴定结果见图9。

图9 pET30a-LAPNb 3-6-2融合蛋白的纯化鉴定   

2.7 pET30a-LAPNb 3-6-2融合蛋白的Western Blot验证

诱导破碎后的沉淀物经包涵体蛋白变性、复性后进行亲和层析纯化，纯化的目的蛋白使用Western Blot法（一抗为鼠源His tag，二抗为用HRP标记的山羊抗鼠IgG）验证，结果见图10。电泳结果显示，有一个条带（大小约为28 KD，与目的蛋白理论分子量大小基本吻合）与实验预期结果相符。

泳道1中55 KD处的条带可能显示的是二聚体。

图1 0 ET30a-LAPNb 3-6-2融合蛋白的Western blotting鉴定图  

2.8 串联纳米抗体LAPNb 3-6-2与其靶抗原Em-LAP的亲和力鉴定

用双抗体夹心法检测纯化纳米抗体LAPNb3-6-2蛋白与靶抗原Em-LAP的亲和力，结果见图11,LAPNb 3-6-2与靶抗原Em-LAP具有较高亲和力。

图1 1 纳米抗体LAPNb 3-6-2与靶抗原Em-LAP的亲和力鉴定

3、讨论

纳米抗体是一种单域抗体，具有较强的抗原靶向性和结合性，与传统的抗体比较，具有多种优势。由于Nb分子量小，相对更容易进入组织中，甚至可以穿透血脑屏障[1]，在Nb长而突出的CDR3环上暴露出一个凸面，这两个特征使它们更容易进入传统抗体无法进入的受体间隙或结合袋，它们也可以到达隐藏表位，包括离子通道[2]、G蛋白偶联受体[3]和免疫突触[4]。目前有许多研究将纳米抗体应用到感染性疾病[5]、血液性疾病[6]的诊断和治疗中。另外，纳米抗体在体外诊断的应用主要包括光学成像、超声分子成像、核成像技术及相关治疗。PET探针使用68Ga、89Zr、64Gu、18F、86Y等与纳米抗体结合用于免疫PET成像，而SPECT探针使用99mTC、131I、177Lu等与纳米抗体结合用于免疫SPECT成像[7]。利用纳米气泡[8]将特定的纳米抗体运送到目标部位，在超声照射下破裂后诱导肿瘤成像。此外，基于纳米抗体的CAR已经在十多种不同的肿瘤，尤其是血液系统恶性肿瘤的特异性靶点上显示出被证实的功能；在Jurkat细胞、NK细胞或原代T细胞中转导后，得到的基于纳米抗体的CAR-T细胞或CAR-NK细胞在体外和体内均显示出抗肿瘤作用[9]。在寄生虫治疗方面，有研究者[10,11]对非洲锥虫和疟原虫等寄生虫的相关抗原进行了纳米抗体的筛选，用于诊断和治疗。在棘球蚴病中，有研究者针对多房棘球蚴病和细粒棘球蚴病筛选出了mAb EmG3IgM、mAb EmG3IgG1、mAb AgB、mAb2B2、mAb Em2G11等多种单克隆抗体，用于这两种疾病的诊断[12]，但目前未见诊断及治疗多房棘球蚴病的纳米抗体。

LAP在多种生物体内广泛存在，Em-LAP是属于M17氨基肽酶家族的锌金属蛋白酶，可催化多肽氨基末端亮氨酸残基的水解，在蛋白质分解代谢中起重要作用。LAP作为研究片吸虫[13]、曼氏血吸虫[14]等多种寄生虫的特异性诊断及药物靶向治疗的蛋白[15]，在寄生虫定殖宿主过程中的组织入侵和寄生虫营养及逃避宿主免疫反应中起到重要支持作用[16]。本课题组的前期研究发现，Em-LAP参与了多房棘球蚴的侵袭和纤维化过程；抑制Em-LAP可减少一些关键氨基酸的合成，促进胶原纤维和弹性纤维的合成，从而减少囊肿的侵袭和纤维化[17]。

酶活性中心是酶催化反应的关键部位，是酶分子中与底物特异性结合并催化底物为产物的区域。在酶促反应的过程中，抑制剂与酶活性中心的必需基团结合，使酶活性降低或者消失。通过分子对接筛选具有抑制Em-LAP蛋白活性的阳性单克隆子，得到潜在抑制Em-LAP蛋白活性的阳性株[18]。在本研究中，使用生物信息学软件ZDOCK预测纳米抗体LAPNb 3-1、LAPNb 3-2、LAPNb 3-6、LAPNb3-7、LAPNb 3-10与靶抗原蛋白Em-LAP的三维对接情况，继而筛选出可与Em-LAP酶活性中心特异性结合的纳米抗体LAPNb 3-6。

从非免疫合成文库中分离的纳米抗体，通常缺乏治疗用途所需的高结合亲和性或生物分析应用的高灵敏性，一些研究将其与柔性连接体连接来提高纳米体的亲和力[19]。在本研究中，使用柔性序列串联LAPNb 3-6，提高纳米抗体对靶蛋白Em-LAP的亲和力，也可以延长体内半衰期；用ZDOCK软件预测串联纳米抗体与靶蛋白的三维对接情况，选择结构延展性好的LAPNb 3-6-2，优化密码子后构建其表达系统获取重组蛋白后发现，其与LAP具有较好的亲和力。下一步我们计划将纯化获得的LAP-Nb 3-6-2蛋白进行体外酶活性分析和动物体内活性评价，为AE治疗提供新思路。

参考文献:

[15]杨宝良,洛桑达哇,刘文磊,等.多房棘球绦虫亮氨酰氨肽酶抗原表位的生物信息学预测[J].中国高原医学与生物学杂志,2017,38(4):223-234.

基金资助:国家自然科学基金地区项目(81860299,32360192); 青海省科技厅应用基础研究项目(2024-ZJ-909);

文章来源:戴瑶,刘文婧,肖杨,等.抗多房棘球蚴亮氨酸氨基肽酶纳米抗体筛选及原核表达纯化[J].中国高原医学与生物学杂志,2024,45(03):167-178.