内皮细胞是血液和血管壁之间的重要屏障，其表面被糖蛋白和蛋白聚糖组成的糖萼层覆盖，内皮糖萼具有多种生物功能，包括调节物质交换/运输、细胞黏附以及维持血管稳态[1,2]。研究证实，血脂异常、高血压、高血糖等因素会引起血管内皮糖萼损伤，糖萼的丢失或降解可能导致局部血管扩张、通透性改变，进而诱发炎症，导致内皮稳态的失衡[3,4],这些变化是许多疾病(包括动脉粥样硬化)的病理生理学基础[5,6]。动脉粥样硬化会导致心肌梗死、脑卒中等多种严重心脑血管疾病，其病死率居各类疾病之首[7]。目前，学术界广泛认可动脉粥样硬化是一种血管慢性炎症性疾病。其中，血管内皮功能障碍导致的单核-巨噬细胞的浸润和泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化的关键启动步骤，且炎症反应会伴随疾病发展的全过程[8]。但现有应用于改善内皮功能障碍、降低心血管事件发生率的抗炎药物具有较大局限性[9,10],亟须探索维持血管局部炎症稳态的新靶点及干预手段。

唾液酸特异性Ig样凝集素(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin, Siglec)是一个唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族，通过识别以唾液酸为末端的聚糖配体来调节先天性和适应性免疫系统中细胞的功能[11,12]。Siglec-9(人源，小鼠同系物为 Siglec-E)表达于人单核/巨噬细胞、中性粒细胞等髓系免疫细胞上，与聚糖配体结合后激活，通过募集SHP-1和SHP-2显著抑制细胞过度炎症反应[13]。Siglec-9特异性识别末端结构为唾液酸Lewis-x(SLex, Neu5Acα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc)的聚糖配体，而不同细胞上的聚糖配体可表现为不同糖蛋白或者糖脂[9]。课题组前期已证实，内皮细胞上存在Siglec-9/E聚糖配体，且在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的炎症刺激下，该聚糖配体表达水平上调，维持血管局部炎症稳态[14]。但目前对Siglec-9/E配体表达变化的机制研究尚不够深入，尤其是对能够调节该配体表达水平的有临床应用前景的干预手段尚缺乏报道。本研究使用人原代肺动脉内皮细胞，旨在从该聚糖配体的合成底物中筛选出能够调节其表达水平的单糖，并阐明其分子机制，从糖生物学角度以维持血管局部炎症稳态为方向，以调节内皮细胞上Siglec-9聚糖配体表达水平作为动脉粥样硬化全新干预靶点并为探索干预策略提供理论和实验室支持。

1、材料与方法

1.1 试剂与仪器

人原代肺动脉内皮细胞和人急性单核白血病细胞(tohoku hospital pediatrics-1,THP-1)购自ATCC细胞库，原代内皮细胞专用培养基购自赛百慷上海生物技术有限公司；半乳糖购自中国上海麦克林生化科技有限公司；RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、抗荧光淬灭封片、FITC-山羊抗人IgG Fc抗体均购自上海碧云天生物技术有限公司；α2-3,6,8唾液酸酶购自美国New England BioLabs公司；重组人Siglec-9 Fc蛋白购自美国R&D公司；重组人Siglec-9蛋白购自美国MedChemExpress公司；PE-抗人IgG Fc重组抗体购自美国Biolegend公司；ST3Gal-Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ抗体购自英国Abcam公司；GNE、NANS、NANP、CMAS、NPL抗体均购自美国Thermofisher公司；NANP siRNA(h)、CMAS siRNA(h)、ST3Gal-Ⅲ siRNA(h)购自美国Santa Cruz公司；EZ-Red大肠杆菌荧光颗粒-PE购自美国Biovision公司；流式细胞仪型号为BD AccruiTMC6(美国);激光共聚焦显微镜型号为Zeiss LSM 900;显影仪型号为GelView 6000 Pro。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

配置完全培养基：在内皮细胞基础培养基中加入10%的胎牛血清、1%青-链霉素(双抗)、1%谷氨酰胺、1%内皮细胞生长因子(endothelial cell growth supplement, ECGS)、1%肝素钠，用于培养内皮细胞，当细胞密度达到80%左右传代。培养箱设置为37 ℃、5%CO2。

1.2.2 流式细胞术鉴定Siglec-9聚糖配体末端糖苷键类型

收集重悬上述培养好的内皮细胞，按106个/100 μL加入0.5 μL MAL Ⅱ Biotinylated 4 ℃孵育30 min。DPBS洗涤3次后，加入1 μL APC-streptavidin和1 μL FITC-SNA,室温避光孵育20 min。DPBS清洗并过70 μm细胞筛后，使用流式细胞仪检测。

1.2.3 流式细胞术检测内皮细胞Siglec-9聚糖配体表达以及不同糖对其表达水平的影响

将内皮细胞(1×105个/mL)接种于12孔板中(n=3),并进行以下分组：对照组、左旋葡萄糖组(20 μmol/L)、葡萄糖组(20 μmol/L)、N-乙酰基葡萄糖组(20 μmol/L)、半乳糖组(20 μmol/L)、甘露糖组(20 μmol/L)、N-乙酰基甘露糖组(20 μmol/L)、唾液酸组(20 μmol/L)、蔗糖组(20 μmol/L),然后将12孔板放置于37 ℃培养箱中培养48 h。收集各组细胞，每100 μL体积加入8 μL重组人Siglec-9 Fc蛋白，4 ℃孵育1 h。DPBS洗涤3次后，加入PE-抗人IgG Fc重组抗体，室温避光孵育20 min。DPBS清洗，并过70 μm细胞筛后，使用流式细胞仪检测。

1.2.4 免疫荧光法

将内皮细胞(5×104个/mL)接种于已放置细胞爬片的24孔板中，对内皮细胞进行以下分组：对照组、半乳糖(12.5、25、50 μmol/L)组，然后置于37 ℃培养箱中培养48 h。多聚甲醛固定15 min, DPBS清洗3次。5%山羊血清室温封闭1 h。加入重组人Siglec-9 Fc蛋白，4 ℃孵育过夜。DPBS清洗3次，加入FITC-山羊抗人IgG Fc抗体，室温避光孵育2 h。DPBS清洗3次，捞片，抗荧光淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.2.5 Western blot 测定内皮细胞 Siglec-9 聚糖配体以及配体合成关键酶表达水平

唾液酸酶处理内皮细胞：将内皮细胞接种于24孔板中，加入含有300 U α2-3,6,8唾液酸酶的培养基后，于37 ℃培养箱中培养12 h, DPBS清洗后，进行后续实验。收集处理好的各组内皮细胞，加入RIPA细胞裂解液，于冰上裂解20 min后，12 000 r/min 离心10 min, 取上清，BCA法测定蛋白质含量并调平。样品100 ℃加热10 min, SDS凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h。随后分别用ST3Gal-Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ抗体，GNE、NANS、NANP、CMAS、NPL抗体4 ℃孵育过夜，PBST清洗3次后加入相应二抗，室温孵育1 h, PBST清洗3次，发光液显影后采集图片。

1.2.6 RT-qPCR验证内皮细胞内NANP/CMAS/ST3Gal-Ⅲ的mRNA水平

半乳糖处理内皮细胞0、12、24、36、48 h后，根据TIANGEN公司RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒的操作指南提取RNA;然后根据TaKaRa公司的反转录试剂盒的操作指南进行反转录，获得cDNA;最后以cDNA为模板根据TaKaRa公司的RT-qPCR试剂盒说明书进行操作，引物序列见表1。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt 法进行数据的计算。

1.2.7 siRNA实验

采用Santa Cruz siRNA 转染试剂，根据试剂说明书将NANP siRNA、CMAS siRNA、ST3Gal-Ⅲ siRNA以及对照siRNA分别转染内皮细胞，抑制NANP/CMAS/ST3Gal-Ⅲ在细胞中的表达。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.8 流式细胞术检测与内皮细胞共培养后巨噬细胞的凋亡与吞噬能力

半乳糖处理内皮细胞48 h, 同时THP-1用佛波酯刺激分化为巨噬细胞。将巨噬细胞消化下来，按1×105个/mL接种于12孔板中与内皮细胞共培养24 h。将细胞分组为：巨噬细胞组、巨噬细胞+内皮细胞组、巨噬细胞+半乳糖处理的内皮细胞组，巨噬细胞+半乳糖处理后重组Siglec-9蛋白封闭的内皮细胞组。

凋亡检测：消化离心收集各组细胞，每100 μL体积加1.5 μL PE-CD11b, 避光孵育20 min。PBS清洗1次，采用APC-AnnexinV/7-AAD双染法，流式细胞仪检测巨噬细胞凋亡情况。

吞噬能力检测：在共培养22 h时，每孔加入3 μL EZ-Red大肠杆菌荧光颗粒-PE(EZ-Red E.coil PE),消化收集各组细胞，每100 μL体积加1.5 μL CD11b避光孵育20 min。PBS清洗后，200 μL PBS重悬过滤，流式细胞仪检测各组巨噬细胞吞噬荧光颗粒的情况。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0统计软件，计量资料以

表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用Student’s t检验，检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 内皮细胞表达Siglec-9 聚糖配体

Western blot检测结果显示，内皮细胞上Siglec-9聚糖配体的相对质量约为60×103,且经过α2-3,6,8唾液酸酶处理后该条带信号消失(P<0.01,图1A)。流式细胞术检测结果验证该配体在内皮细胞细胞膜表面表达(图1B),且MALⅡ和SNA染色结果显示，该聚糖配体是末端结构为α2-3连接的唾液酸糖蛋白(图1C、D)。

2.2 半乳糖能上调内皮细胞表面Siglec-9聚糖配体的表达

流式细胞术检测不同糖刺激内皮细胞Siglec-9聚糖配体表达水平。结果显示，与对照组比较，半乳糖组、甘露糖组、N-乙酰基甘露糖组以及唾液酸组刺激内皮细胞 Siglec-9聚糖配体显著升高，且半乳糖组升高趋势最显著(P<0.01,图2A)。流式细胞术检测结果显示，随着半乳糖给予的浓度增高，内皮细胞表面 Siglec-9聚糖配体表达水平也逐渐升高(P<0.01,图2B)。Western blot和细胞免疫荧光检测结果与上述结果一致(图2C、D)。

2.3 半乳糖不影响内皮细胞上Siglec-9聚糖配体恢复时间

为进一步探究半乳糖对内皮细胞表面Siglec-9聚糖配体的影响，用唾液酸酶切除内皮细胞表面Siglec-9聚糖配体后，再加入含半乳糖的培养基继续培养0、3、6、12 h。结果显示，聚糖配体会在6 h后恢复正常水平，且在短时间内添加半乳糖不会影响内皮细胞上Siglec-9聚糖配体恢复的时间(图3)。

图1 内皮细胞表达Siglec-9聚糖配体(n=3,±s)   

图2 半乳糖上调内皮细胞Siglec-9聚糖配体的表达(n=3,±s)   

图3 半乳糖对内皮细胞上Siglec-9聚糖配体恢复时间的影响(n=3,±s)   

2.4 半乳糖处理后，内皮细胞Siglec-9聚糖配体合成关键酶的表达增加

与对照组比较，半乳糖组唾液酸生物合成的关键酶中，胞质中的N-乙酰神经氨酸磷酸酶(N-acetylneuraminic acid phosphatase, NANP)、细胞核中的胞苷单磷酸N-乙酰神经氨酸合成酶(cytidine monophosphate N-acetylneuraminic acid synthetase, CMAS),以及高尔基体内的ST-β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶3(ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 3, ST3Gal-Ⅲ )的表达显著升高(图4A、B)。RT-qPCR验证相关酶基因在给予内皮细胞半乳糖24 h时有显著上调(图4C),提示半乳糖能通过上调内皮细胞内Siglec-9 聚糖配体合成的关键酶的表达来升高Siglec-9聚糖配体本身的表达。

图4 半乳糖对内皮细胞Siglec-9聚糖配体合成关键酶的影响(n=3,±s)   

2.5 敲低NANP、CMAS、ST3Gal-Ⅲ的表达逆转了内皮细胞上Siglec-9聚糖配体水平的升高

为了进一步证明NANP、CMAS、ST3Gal-Ⅲ在Siglec-9聚糖配体中的调节作用，用siRNA干扰技术分别敲低内皮细胞NANP、CMAS、ST3Gal-Ⅲ 的表达后，给予半乳糖刺激48 h, Western blot检测其敲低效率以及内皮细胞上Siglec-9聚糖配体的表达量。结果表明，与对照组比较，抑制NANP、CMAS或ST3Gal-Ⅲ 的表达均导致内皮细胞上Siglec-9聚糖配体的表达水平下降，半乳糖的添加并不能逆转这一变化(P<0.01,图5)。

2.6 内皮细胞Siglec-9聚糖配体表达增加抑制共培养巨噬细胞活性

为研究内皮细胞Siglec-9聚糖配体表达变化对共培养巨噬细胞活性影响，用半乳糖诱导内皮细胞Siglec-9聚糖配体表达增加后，将其与巨噬细胞共培养24 h, 流式细胞术检测巨噬细胞凋亡情况和吞噬能力。结果显示：与未加半乳糖的共培养组比较，内皮细胞表面Siglec-9聚糖配体表达上调后，导致巨噬细胞凋亡增加(P<0.01,图6A),吞噬能力明显减弱(P<0.05,图6B)。利用重组Siglec-9蛋白封闭内皮细胞上的Siglec-9聚糖配体后，逆转了共培养的巨噬细胞的凋亡和吞噬能力的变化。

3、讨论

内皮糖萼覆盖全身所有血管的管腔表面，主要由糖胺聚糖、唾液酸聚糖以及糖蛋白构成，在血管的调节、保护以及减弱白细胞黏附等方面起着关键作用[15]。病理条件下，内皮糖萼的功能障碍会诱导血管炎症性疾病的发展[16,17]。而炎症是动脉粥样硬化发展的驱动力，因此，靶向炎症途径可以为预防和治疗动脉粥样硬化提供新的途径[18]。Siglec-9聚糖配体作为内皮糖萼的重要组成部分[4],其表达水平的变化对维持内皮糖萼完整性以及血管局部炎症稳态有重要生理意义。

图5 NANP、CMAS、ST3Gal-Ⅲ对内皮细胞上Siglec-9聚糖配体水平的调节作用(n=3,±s)   

图6 内皮细胞Siglec-9聚糖配体表达增加抑制共培养巨噬细胞活性(n=3,±s)

现有研究证实，Siglec-9与聚糖配体结合后，会传导一系列抑制性信号[19],例如，抑制中性粒细胞与巨噬细胞活化[20,21]。最新研究发现，人肥大细胞上也存在Siglec-9及其聚糖配体的表达，靶向Siglec-9能抑制肥大细胞释放促炎介质的能力，减轻过敏反应[22]。Siglec-9通过识别其聚糖配体来调节免疫细胞功能，所以配体是激活Siglec-9的必要条件。研究表明，不同组织器官中的Siglec-9聚糖配体表现各异，在生理或病理过程中发挥着重要作用，例如Glycophorin A,作为红细胞上Siglec-9聚糖配体维持外周血液循环中性粒细胞“静默”的作用[21],以及本课题组前期发现的MUC5B,作为气管上皮细胞上Siglec-9/E 聚糖配体参与呼吸道炎症过程[23]。也有研究发现，人工合成的Siglec-9聚糖配体可抑制与 COVID-19 相关的中性粒细胞活化[24]。以上结果提示，Siglec-9聚糖配体表达水平的调节方式有两种，一种是外源性配体的添加[24],另一种是从内部调节。课题组前期研究证实，可以通过UDP-葡萄糖4-差向异构酶(UDP-galactose-4-epimerase, GALE)或NF-κB通路上调人/鼠内皮细胞上Siglec-9/E聚糖配体的表达水平，抑制血管局部炎症反应[14,25]。基于前期研究，本研究继续寻找新的调节内皮细胞Siglec-9聚糖配体表达水平的手段。

唾液酸作为Siglec-9聚糖配体的关键组成部分，其合成酶和转移酶在调控细胞Siglec-9聚糖配体水平上有重要作用。唾液酸从合成到添加至细胞聚糖末端一共分为3个步骤：唾液酸合成、唾液酸CMP化以及CMP-唾液酸的转移运输。GNE、NANS、NPL、NANP均为唾液酸合成路线上的关键酶，CMAS负责将唾液酸活化为CMP-唾液酸，只有活化的唾液酸才能作为糖基供体被唾液酸转移酶所利用，连接到特定糖脂或糖蛋白的糖链末端[26,27,28]。本研究结果进一步确定血管内皮细胞上Siglec-9聚糖配体是末端结构为α2-3连接的唾液酸糖蛋白。与对照组比较，半乳糖处理的内皮细胞上Siglec-9聚糖配体表达水平升高，同时细胞中唾液酸合成路线中最后一步的NANP,活化唾液酸的CMAS以及唾液酸转移酶ST3Gal-Ⅲ在mRNA和蛋白水平均显著上调。这与研究报道的ST3Gal-Ⅲ调节小鼠Siglec-F配体形成抑制嗜酸性粒细胞肺炎的结果一致[29,30],且CMAS高表达与癌症细胞的高唾液酸化以免疫逃避密切相关[31,32]。而外加的半乳糖不能缩短被唾液酸酶切除后内皮细胞上聚糖配体恢复的时间。这可能是由于内皮细胞 Siglec-9聚糖配体仅需6 h即可恢复正常水平，但外源性半乳糖的掺入后，引起聚糖配体上调的一系列信号传导需要更长的时间，即聚糖配体合成关键酶的mRNA水平在24 h时检测到有显著上调。以上结果提示，半乳糖上调内皮细胞 Siglec-9聚糖配体的方式不是直接在切除唾液酸后暴露的半乳糖残基上原位添加唾液酸，而可能是通过唾液酸聚糖合成途径，促进内皮细胞膜蛋白上糖链的新生的方式导致聚糖配体的增加。

在共培养体系中，半乳糖处理后的内皮细胞增加了巨噬细胞的凋亡，并一定程度地抑制了巨噬细胞的吞噬作用。原因可能是激活Siglec-9可以抑制巨噬细胞活性并诱导巨噬细胞凋亡，这与既往研究结果相似，红细胞上的聚糖配体(glycophorin A)与中性粒上Siglec-9结合同样会诱导人中性粒细胞凋亡[21,33]。

由于单核-巨噬细胞的黏附和浸润是血管炎症的关键启动步骤，因此维持内皮糖萼完整性、减少单核-巨噬细胞黏附浸润是预防和治疗动脉粥样硬化等血管炎症疾病的有效靶点[5,9,15]。本研究发现，内皮细胞上Siglec-9聚糖配体的表达通过半乳糖刺激而增加，抑制巨噬细胞的免疫应答，可能为抑制血管局部炎症反应提供潜在的新策略。但长期大剂量摄入半乳糖会导致肝肾毒性[34,35],如何提高其调节Siglec-9聚糖配体水平效率和安全性以作为临床应用的有效干预手段，需要在结构优化改造等方面进行更深入的探索。

基金资助:国家自然科学基金面上项目(81973319)~~;

文章来源:吴妮婷,摄渊婷,刘红梅,等.半乳糖上调内皮细胞Siglec-9聚糖配体水平抑制巨噬细胞活性[J].陆军军医大学学报,2024,46(13):1502-1511.