幽门螺杆菌(Hp)是一种螺旋形、微需氧的革兰阴性菌，有3～5根端鞭毛用以保持运动，是定植在人胃上皮细胞中最特异的病原微生物，能通过黏附及入胞引起胃炎、胃十二指肠溃疡及胃肿瘤等疾病。Hp感染后主要分4步致病：(1)寻找定植点，细菌鞭毛在定植中发挥重要作用，Hp可以通过鞭毛游走、摆动寻找定植点[1]。鞭毛的主要结构蛋白包括Hp黏附素A、鞭毛蛋白A、鞭毛蛋白B、鞭毛蛋白D、鞭毛蛋白K等，这些鞭毛蛋白也是感染后体液免疫的主要靶点。(2)改造微环境，Hp通过游走可在胃黏液层与胃上皮间短暂停留，然后释放毒力因子脲酶调节胃内pH值以达到适宜的生存条件。(3)黏附定植，细菌黏附被认为是Hp引起胃部发病最关键的步骤，当该菌定植在胃黏膜上时，其黏附素与细胞受体相互作用可以对Hp形成保护作用，避免被胃蠕动、胃排空及胃上皮细胞的脱落排出。同时，Hp通过黏附可以从宿主细胞获得代谢底物和能量。(4)释放毒素引起损伤，Hp在胃黏膜上定植后会释放相关毒素如细胞毒素相关基因A蛋白(CagA)、空泡毒素(VacA)和十二指肠溃疡启动蛋白A等引起宿主细胞损伤和发生炎症反应，且能通过免疫逃逸引起持续感染。此外，有研究发现Hp外膜囊泡(OMVs)作为一种特殊的载体，也可在细菌与细菌间及细菌与细胞间进行信号传递和物质交换，从而参与到Hp的致病机制中[1]。

1、 Hp OMVs的组成

OMVs普遍存在于所有生物个体中[2],同其他革兰阴性菌一样，Hp也能释放OMVs。该囊泡可以充当载体参与遗传物质、蛋白质和信号分子间的传递，并在病原菌致病机制中发挥重要作用[3,4]。目前已知OMVs有3种不同的传递模式：(1)靶向裂解，通过与靶细胞上受体结合，释放囊泡内容物。(2)黏附融合，囊泡膜与另一细胞黏附后发生融合，囊泡腔内的物质被转移，这种机制对细菌菌株间遗传物质水平转移以及细菌不同物种间遗传物质水平转移具有重要意义。(3)真核细胞的内吞作用。JAREAB等[5]首次通过双银染色分析了Hp的OMVs。有研究表明，Hp的OMVs大小为20～500 nm, 不同菌株间OMVs大小差异较大[6]。其中，脲酶A亚基和B亚基、VacA、中性粒细胞活化蛋白(NAP)和孔蛋白(HopA)几乎存在于所有OMVs中，均与Hp 存活和毒力有关。较大的OMVs(90～450 nm)含有几种已知的Hp 黏附素，例如唾液酸结合黏附素(SabA)、血型抗原结合黏附素(BabA)、铁调节蛋白、Hp外膜蛋白家族、鞭毛基底蛋白和钩蛋白，这些蛋白质在较小的OMVs(20～100 nm)中均不存在，较小的OMVs中仅有4种蛋白质与代谢有关，与毒力或黏附力无关[7]。因此，OMVs蛋白水平的不同在致病上就可能具有异质性。Hp OMVs是含蛋白质、脂多糖(LPS)、磷脂、肽聚糖、RNA和DNA分子的复杂组装体[8],其中已鉴定出的磷脂有：磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰乙醇胺和心磷脂[9]。蛋白质组学分析表明，OMVs中含有脲酶、CagA、VacA、LPS、孔蛋白、脂蛋白、各种黏附素(SabA、BabA)、黏附相关脂蛋白A/B(AlpA)/(AlpB)、炎症外膜蛋白A(OipA)、Hp-NAP和其他相关毒力因子等[10,11,12]。这些物质既可以定位在囊泡腔内，也可以被整合到囊泡膜中。有研究推测OMVs可能携带了母菌几乎所有的物质，进而模拟母菌的致病性，但目前尚无证据表明OMVs具有生物遗传特性[4]。

2、OMVs在Hp定植中的协同作用

Hp 定植是一个多步骤复杂的过程，OMVs可能在Hp 的定植中起到了协同作用。OMVs中的脲酶可以缓冲胃酸，这对Hp在人胃中的成功定植至关重要，而Hp OMVs由于相对分子质量小，更容易穿透黏液层，可以将携带的脲酶运送至更深的黏液位置，为母菌的成功定植奠定基础。Hp可以分泌多种黏附素来介导菌体与宿主细胞间的相互作用，促进其成功定植，而胃上皮细胞对Hp OMVs的摄取主要靠内吞作用或脂筏介导，且依赖于OMVs上暴露的黏附素[13],这种囊泡与宿主细胞的接触可能使母菌与宿主细胞保持安全距离，从而保护菌体免受宿主免疫细胞的细胞毒作用，达到摄取营养物质的目的。

3、 Hp OMVs致病机制

3.1 转运毒力因子

VacA作为Hp最主要的毒素之一，几乎存在于所有的菌株中。有研究表明，Hp的VacA约75%以可溶形式释放，其余25%与OMVs有关[14,15]。Hp OMVs表面的VacA能与宿主细胞膜中的脂质双层结合，形成阴离子选择性和电压依赖性通道，引起宿主细胞内容物的外排，这可能有利于Hp的生长。同时，结合VacA的OMVs还能通过线粒体依赖途径诱导上皮细胞空泡化和内质网应激，促进胃上皮细胞的自噬和凋亡[16,17]。Hp可能通过这种自噬在胃上皮细胞和巨噬细胞中得以生存、繁殖并引起患者慢性持续性感染[18]。

CagA作为Hp最经典的细胞毒素，由Hp CagA致病岛编码，主要通过Ⅳ型分泌系统注入宿主细胞，在肿瘤的发生与发展过程中发挥着重要的作用。OMVs转运的CagA也能在胃上皮细胞基底的形成、细胞骨架的变化、细胞的增殖以及刺激胃上皮细胞分泌白细胞介素(IL)-8促进产生炎症反应等方面影响宿主细胞[19]。而IL-8与慢性萎缩性胃炎和胃癌的形成密切相关，此外，还可作为启动子对生物信号蛋白直接或间接作用，影响宿主细胞信号通路，导致癌基因上调，促进细胞增殖、转移分化、减少细胞凋亡，从而利于肿瘤的发生[20]。有研究表明，Hp OMVs可能是继Ⅳ型分泌系统后的另一种新型替代分泌途径[19]。

Hp-NAP对人类单核细胞和中性粒细胞具有趋化作用，能刺激细胞产生活性氧(ROS),ROS可以破坏胃上皮细胞的完整性。OMVs可将Hp-NAP传递到胃黏膜，并通过ROS介导黏膜损伤[21]。丝氨酸蛋白酶作为一种分泌性毒力因子也可从OMVs中鉴定出来，其主要通过靶向胃上皮细胞的钙黏蛋白来破坏细胞间的黏附连接，促进Hp向胃上皮细胞迁移定植[22]。Hp产生的过氧化氢酶是一种可以抵消宿主呼吸爆发的抗氧化酶，OMVs通过富集过氧化氢酶来消除细胞外ROS介导的杀伤，是其逃避先天免疫系统攻击的机制[23]。此外，Hp OMVs还能通过β2整合素CD11/CD18和细胞间黏附分子-1依赖性途径引起嗜酸性粒细胞脱颗粒并损伤上皮[24]。

3.2 协同免疫逃逸

Hp作为致癌物，虽然其感染率高，但其在与人类共同进化的过程中并未被免疫系统清除，除非给与特定的抗菌药物治疗。Hp已经衍生出许多的逃逸机制来逃避被宿主免疫系统清除。在免疫识别环节，Hp通过修饰自身结构逃避宿主免疫系统的识别，同时诱导机体产生免疫耐受，如鞭毛蛋白N端D1结构域的TOll样受体(TLR)-5识别位点发生突变，可以影响宿主对该菌的识别和清除[25]。在应答环节，Hp一方面对抗原呈递细胞进行调控的同时还抑制树突状细胞的分化和成熟[26];另一方面Hp还通过诱导巨噬细胞凋亡使其免于被清除[27]。有研究表明，Hp OMVs可以将细菌肽聚糖(PG)转运至细胞内，与含核苷酸结合寡聚化域蛋白(NOD)1和丝氨酸/苏氨酸激酶2(RIP2)结合引起胃黏膜上皮细胞自噬[28],而自噬可能是该菌逃逸免疫的另一种机制。Hp OMVs还可能通过NOD1或TLR4反应运输PG或LPS等毒素来促进核因子-κB的活化和IL-8的产生[20]。同时，NOD1信号通路还能促进IL-33分泌，增强辅助型T淋巴细胞2型免疫反应以抑制炎症反应，在该菌的长期定植中具有促进作用[29]。OMVs还能协助Hp的免疫调节因子VacA和γ-谷氨酰转移酶穿过上皮细胞直接与免疫细胞相互作用，通过抑制T淋巴细胞增殖和调节树突状细胞活化来介导免疫耐受[30]。LPS是Hp OMVs的另一个重要组成部分，LPS中包含特殊结构的脂质A,因其不能很好地激活TLR4可导致Hp发生免疫逃逸。同时，LPS的O特异区域中的路易斯抗原由于与宿主自身抗原具有相似性，也会导致Hp发生免疫逃逸[31]。

综上所述，Hp通过OMVs在感染早期可以引起急性炎症，而在后期则通过传递毒素、调节宿主细胞内信号通路等途径建立自身的免疫耐受，免于被宿主免疫系统清除。

3.3 促进肿瘤形成

Hp相关恶性肿瘤的形成与宿主免疫功能降低及Hp相关毒素引起宿主细胞结构和功能的改变密切相关[32]。VacA和CagA是Hp 最主要的两种毒素，Hp OMVs也携带了这两种毒素。其中，Hp OMVs携带的CagA能以CagA磷酸依赖性和磷酸非依赖性的方式调节细胞的极性及其生长、运动过程，从而导致宿主细胞染色质改变及发生转录错误，促进癌症的发展[33]。此外，含有CagA的Hp OMVs还可以增加ATP对H1组蛋白的亲和力，从而改变核小体内DNA和组蛋白的结合[34]。这可能对宿主基因的转录产生影响，进而导致发生感染或进展为癌症。有研究通过对健康对照组、十二指肠溃疡、胃溃疡和胃癌患者胃液样本中提取的Hp OMVs进行分析发现，Hp OMVs在胃癌患者胃液中的水平明显高于健康对照组[32],说明Hp OMVs可能参与了胃癌的发展，并可能与OMVs水平呈正相关。此外，由于Hp OMVs可以通过NOD1依赖方式诱导先天性和适应性免疫反应，进而以促炎和抗炎的方式调节免疫细胞的增殖和凋亡，导致免疫系统调节紊乱，免疫监视功能降低，这可能导致肿瘤的发生。Hp OMVs可以通过携带毒素因子引起宿主细胞结构改变，扰乱宿主免疫细胞功能，促进相关肿瘤的发生，但该OMVs在促进Hp 感染及相关胃癌发展中的具体机制还需要更多的研究来确定。

4、 Hp OMVs的应用价值

4.1 疫苗开发

基于Hp 的感染现状及其根治的复杂性，疫苗的研发成为提前预防Hp感染较为有效的方式，目前已研发出多种与Hp 有关的疫苗，包括全菌疫苗和含细菌自身成分及分泌蛋白的疫苗，如尿素酶疫苗、鞭毛蛋白疫苗、毒力因子疫苗以及外膜蛋白疫苗。目前有诸多疫苗还在研发中，尚无安全、有效、成熟的Hp 疫苗上市应用，其原因较为多样，如全菌疫苗因其成分复杂，容易导致免疫性疾病的发生；尿素酶疫苗虽为目前较为有效的疫苗，但其产生的保护力较低，降低了本身的生产和应用价值；鞭毛蛋白疫苗激活TLR4与TLR5的能力较差，不能有效地激活细胞免疫和体液免疫；毒力因子疫苗，如CagA疫苗虽然在小鼠模型中表现出不错的免疫效果，但是CagA并不是在所有的菌株中都表达，其保守性较差，限制了其应用；外膜蛋白疫苗，如OipA和脂蛋白20虽有一定的防治效果，但其受限于Hp 菌株外膜蛋白高度易变性，为疫苗的有效性增加了困难[35]。WANG等[32]从Hp中分离出OMVs作为免疫原进行灌胃免疫小鼠，引起小鼠强烈的体液免疫应答、黏膜免疫反应和辅助型T淋巴细胞2免疫应答，并且能明显抑制小鼠胃内Hp的定植，证明OMVs作为新的候选疫苗对降低Hp感染具有重要价值。但目前对Hp OMVs的致病机制还未完全明了，有关该疫苗相关的研究也较少，还有待进一步研究。

4.2 运输载体

目前对于Hp 感染后主要的治疗手段还是以抗菌药物根除为主的三联或四联疗法，但Hp表现出的全球耐药趋势并不乐观。Hp抗菌药物耐药性在世界范围内已达到警戒水平。在国外，以质子泵抑制剂为基础的三联疗法的根除率已降至80%以下[36]。OMVs由于其脂质双分子层的特性可以包裹靶蛋白并通过自身的3种模式进行靶蛋白传递，使靶蛋白不易被机体过快清除，可以作为一种高效的运输载体[22]。因此，Hp OMVs可以设计成包裹载体，用以递送抗原或小分子药物至胃中，为抗菌药物的有效应用提供新的运载方式。

4.3 生物标志物的应用

Hp作为Ⅰ类致癌物，其引起的胃癌及相关肿瘤已成为全球病死率较高的病因之一。目前Hp的检查主要包括侵入性检查和非侵入性检查两大类。侵入性检查通过内窥镜活检后进行Hp培养、酶学分析、组织学染色或者采用聚合酶链反应(PCR)进行分子学检测。其中，PCR的灵敏度和特异度都较强，为83.8%～85.4%和79.5%～99.5%[37],能在检测毒力因子的同时还能检测引起抗菌药物耐药的特定突变。非侵入性检测包括尿素呼气试验、血清学抗体检测、Hp粪便抗原检测和PCR检测。由于侵入性检测受操作者钳取部位、熟练程度以及细菌分布差异等因素影响，且操作复杂，所以并没有被纳入常规检测。而非侵入性检测虽然更能让患者接受，但其在灵敏度和特异度上均有待加强。另外，测序作为一种较为精准的检测方式也在临床检测中得到了应用。此外，Hp OMVs几乎包含了母菌所有物质，可以潜在地作为生物标志物载体。因其脂质膜具有保护性作用可以减缓该囊泡在体内的降解，可以考虑从患者血液或其他体液(如唾液、胃液或尿液等)中分离出Hp OMVs进行扩增或者测序等检测。但目前该循环免疫标志物相关的研究较少，主要原因是病原体来源的OMVs与宿主细胞产生的微囊泡在方法学上进行区分仍然比较困难[37]。但随着科学技术的日益发展，这种纳米级的小分子载体可在未来作为检测Hp感染和胃癌癌前病变的诊断工具。

5、小结与展望

Hp在长期与人类共同进化的过程中衍生出许多生存策略。OMVs的发现可能在一定程度上协助了该菌的定植、致病及慢性感染。OMVs通过自身的小分子优势运输脲酶，为母菌的成功定植奠定基础，其通过转运细菌毒素和黏附素等在Hp 的致病和持续感染中发挥协同作用。

由于OMVs含有许多与病原体相关的分子蛋白，如鞭毛、PG和LPS等，不仅能引起先天免疫反应，还能诱导适应性免疫反应。鉴于其免疫原性，OMVs还被用于疫苗的研发[38]。Hp OMVs既可作为抗原又可作为小分子运输载体的特性将成为今后治疗Hp引起的相关疾病的研究热点。

有学者通过基因减毒修饰OMVs后靶向小鼠肿瘤细胞发现，这些微小囊泡可在肿瘤微环境中聚集，并诱导产生人干扰素-γ以激活抗肿瘤反应[34]。这种基于细菌细胞外囊泡的抗肿瘤策略可为Hp OMVs在今后治疗胃肿瘤疾病中提供新的治疗契机。有研究表明，Hp OMVs参与了Hp生物膜的形成，生物膜在细菌定植、持续感染和耐药机制中具有重要作用[39]。近年来，多项研究表明OMVs可携带并传播耐药基因，如肺炎克雷伯菌OMVs可同时携带毒力和耐药基因；碳青霉烯类耐药基因blaOXA-24可通过OMVs在鲍曼不动杆菌耐药菌与敏感菌之间转移；OMVs介导β-内酰胺类耐药基因blaNDM-1在同种属与跨种属间传播等。这种通过OMVs作为载体进行水平基因转移的方式也为Hp 耐药提供了另一种可能机制[38,39,40,41,42]。目前，对于OMVs在Hp定植、致病及应用中的具体细节、机制仍未完全明确，未来还需要从不同的视角对其进行探索，为疾病的诊断和治疗提供参考依据。

参考文献:

[18]欧国俞,谷海瀛.幽门螺杆菌感染与细胞自噬的研究进展[J].中国微生态学杂志,2019,31(4):490-493.

[41]孔红祥,龙海华,杨健,等.白光内镜下胃黏膜形态判断幽门螺杆菌感染的价值[J].中国临床医生杂志,2023,51(2):186-189.

[42]刘卫东,冯燕,惠文佳,等.血清胃功能三项检测对不同类型幽门螺杆菌感染的诊断价值[J].中国临床医生杂志,2023,51(1):57-60.

文章来源:欧国俞,谭东,邹霞,等.外膜囊泡在幽门螺杆菌定植与致病中的作用及其应用价值[J].检验医学与临床,2024,21(13):1972-1976.