缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤是组织损伤常见的原因之一，Wnt经典通路和非经典通路参与了I/R损伤的多个环节。Wnt5a-Frizzled-2通路是Wnt非经典通路中Wnt/Ca2+通路的一部分，在发生再灌注损伤后，细胞中的Wnt5a和Frizzled-2表达增加，Wnt5a与其配体卷曲蛋白-2(Frizzled-2, Fzd-2)结合后被激活[1,2],影响细胞信号转导及细胞内钙超载导致I/R损伤。在脑组织中[3],Fzd是Wnt信号通路和Notch1信号通路的共同作用靶点，脑缺血时Notch1通路被激活，而Notch1通路与Wnt5a-Frizzled-2通路联系紧密，Notch1通路的激活能否通过抑制Wnt5a-Frizzled-2通路从而阻止细胞凋亡的发生，目前没有定论。本文将主要阐述由Wnt5a-Frizzled-2通路介导细胞凋亡对I/R损伤的影响机制及其对心肌和脑I/R损伤治疗的意义，以及Wnt5a-Frizzled-2通路与Notch通路在脑I/R损伤中的相互作用，以期在临床治疗心肌和脑I/R损伤方面提供理论依据和借鉴。

1、Wnts、Frizzleds基因概述

Wnt基因由NUSSE等[4]在1982年发现，称其为Int1基因。研究发现[5],Wnt在胚胎发育和肿瘤形成中有着重要作用，并且发现该基因与调控果蝇的无翅性状的基因(Wingless)密切相关。“Wingless”和“lnt”2个基因合称为Wnt。

Frizzleds基因在果蝇中首次被发现，随后在其他后生动物中也相继有发现，Frizzled基因家族存在于脊椎动物和无脊椎动物中，其表达相应的10种Frizzled蛋白中的一种或多种，可与19种哺乳动物Wnt结合，通过同时或单独激活经典Wnt/β-连环蛋白，非经典Wnt/Ca2+或平面细胞极性(planar cell polarity, PCP)途径产生刺激细胞增殖、细胞运动以及控制细胞生命进程和分化等多种作用[6]。Fzd-2蛋白参与非经典途径Wnt/Ca2+途径，通过激活Fzd-2使异三聚体G蛋白(可能是Go和Gt)释放β/γ亚单位复合物，进而激活磷脂酶C和其他效应物，促进细胞内Ca2+的动员。此外，Fzd-2也是七跨膜节段受体家族(the family of seven transmembrane segment receptors, 7-TMS)受体家族的一员，通过异源三聚体G蛋白与效应器偶联，可以通过G蛋白Gt2、转导蛋白、一种在眼睛光转导中突出的环鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)二酯酶传递信号，参与调节细胞cGMP的水平[7]。

Wnt与Fzd之间信号通路分为β-连环蛋白途径和非β-连环蛋白依赖途径。在经典Wnt通路中[8],已知Wnt配体有Frizzled家族蛋白受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein receptor related protein, LRP)。在非经典Wnt通路中，Wnt分子只与Frizzleds蛋白家族结合。当Frizzleds蛋白家族与Wnt分子结合，Wnt5a和Wnt11可以启动Wnt/Ca2+通路[9]。

非β-连环蛋白途径较为复杂且不断增加，包括多种通路，具有潜在研究价值。Wnt5a既可以参与经典通路，也可以参与非经典通路。当Wnt5a参与非经典通路时，通过Fzd-2激活Ca2+信号通路，提高胞内Ca2+浓度，进而激活钙调素依赖性蛋白激酶(calcium-calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CAMKⅡ)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、钙调磷酸酶(calcineurin, Caln)等转录因子的表达。作为与钙调节蛋白相关的酶，CaMKⅡ对胞内钙稳态的维持有着关键的作用。然而，在缺血缺氧状态下，Ca2+转运失调，大量Ca2+进入细胞质，激活Ca2+依赖性酶促反应，最终引发细胞凋亡。孔令恒等[10]研究发现，在经Krebs-Henseleit液(KH solution)灌注的对照组和KH液与CaMKⅡ抑制剂KN-93处理灌注的药物对照组的大鼠离体心脏中未见心肌死亡，经有钙KH液与无钙KH液反复灌注处理的钙反常组的心肌梗死范围为(18.0±7.2)%,在经KN-93处理和钙反常灌注的KN-93处理组的心肌梗死范围达(90.0±4.8)%,梗死面积是钙反常组的5倍。同时测得对照组、药物对照组、钙反常组的左心室发展压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)分别为6、6和16 mmHg, KN-39处理组左心室舒张末压LVEDP为30 mmHg较其余各组显著提高。以上研究说明，CaMKⅡ的活性可能受到CaMKⅡ抑制剂的影响加重钙超载对于心肌的损伤。

2、Wnt5a-Frizzled-2通路与I/R损伤

炎症反应和细胞内钙超载是I/R损伤的重要机制。Wnt/Ca2+信号通路在调节细胞内钙浓度和参与炎症反应中发挥重要作用，当Wnt5a参与非经典通路，Fzd-2结合后活化的G蛋白和散乱蛋白(dishe-velled, DVL)激活质膜上的磷脂酶C(phospholipase C,PLC),激活的PLC可以将质膜中的4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol diphosphate, PIP2)水解成1,4,5-三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)和1,2-二酰基甘油(diacylglycerol, DG)。IP3直接导致细胞内游离钙浓度升高；而DG则通过激活PKC增加胞内Ca2+通道的磷酸化，促进Ca2+内流。另外，活化后的PKC还可以抑制肌质网钙离子A磷酸酶基因(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase gene, SERCA)的表达，从而促使细胞内Ca2+浓度的进一步升高。细胞内Ca2+浓度的升高还可以激活CAMKII、PKC、Caln, 从而激活核转录相关钙调蛋白活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、环腺苷酸效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)和细胞分裂周期42蛋白(recombinant cell division cycle protein 42,Cdc42)等促进相应的生理生化反应，使得钙泵调节功能紊乱，引起细胞内钙超载[9,10,11,12,13,14],大量内流的Ca2+激活一系列Ca2+依赖性酶促反应，最终导致细胞的凋亡。因此，Wnt5a-Frizzled-2通路的激活是造成细胞内钙超载的主要原因之一。

I/R损伤中，炎症反应是不可忽视的一部分，炎症由再灌注引起，通常发生在没有微生物的情况下，因此被称为无菌炎症。Wnt5a通过Wnt/Ca2+信号通路作用于巨噬细胞，激活CaMKII,诱导分泌炎性因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL- 8)、巨噬细胞炎性因子-1β(macrophage inflammatory protein 1 beta, MIP-1β)等炎性细胞的表达；同时，由于细胞内钙超载导致焦磷酸钙复合物产生和尿酸形成，二者与细胞内炎症小体蛋白质复合物共同介导白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等细胞因子的产生增加，激活转录因子，增加其他细胞因子和趋化因子的表达，从而引发细胞因子风暴，加剧I/R损伤。

2.1 Wnt5a-Frizzled-2通路与心肌I/R损伤

有研究证实：心肌的I/R损伤的原因主要包括大量氧自由基生成、钙超载以及能量代谢障碍[15,16]。周珊珊[15]的研究表明，通过体外细胞培养模拟大鼠心肌细胞I/R损伤后的伤后环境，在大鼠缺氧/复氧心肌细胞中，用定量反转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测Wnt5a和Fzd-2的基因表达水平，发现缺氧/复氧后细胞中的Wnt5a和Fzd-2基因表达水平较正常心肌细胞分别上调了8倍和3倍(P<0.001,P<0.05),用蛋白质印迹(Western blot)法检测相应的Wnt5a和Fzd-2蛋白表达水平，发现缺氧/复氧的细胞Wnt5a和Fzd-2的蛋白表达水平分别提高了7倍和2倍(均P<0.01),激光共聚焦显微镜下也发现经过处理后的细胞中Ca2+荧光强度要比正常细胞高2倍(P<0.01);此外，靶向沉默细胞中的Fzd-2基因表达，细胞内Wnt5a基因的表达随之下降(由9.67±0.71降至2.59±0.62),并且Wnt5a蛋白水平由2.58±0.18降1.09±0.04,胞浆内Ca2+荧光强度也发生显著降低(由0.04±0降至0.02±0)(P<0.001),这表明Wnt5a-Frizzled-2通路在心肌I/R损伤后被激活，并且参与了心肌细胞钙超载的过程。此外，在相关的药物实验研究中发现，较低浓度的白藜芦醇可以抑制I/R心肌细胞中Wnt5a和Fzd-2 mRNA及其蛋白水平的表达，减少细胞内的Ca2+积累，经过5、15或30 μmol·L-1的白藜芦醇处理后缺血再灌注的心肌细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)证明了调控Wnt5a-Frizzled-2通路能够逆转心肌缺血再灌注损伤[17]。另外，10-姜辣素(10-gingerol)可以减轻缺氧/复氧引起的损伤，减少氧化应激、炎症和细胞凋亡、Ca2+超负荷，这与Wnt5a/Frizzled-2途径的抑制有关(P<0.05或P<0.01)[18]。Wnt5a-Frizzled-2通路被激活后，大量的Ca2+进入线粒体，在线粒体的膜上形成磷酸钙并沉积下来，阻碍线粒体正常产能从而产生大量氧自由基攻击细胞，促进细胞凋亡[19];与此同时，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)也被激活，使线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)开放[20],释放的细胞色素C激活胞浆中Caspase-3蛋白，从而引发细胞凋亡[21,22];另外，钙超载激活的酶类还会破坏正常的细胞膜及细胞器的膜结构，从而引起细胞的坏死和凋亡[23]。

2.2 Wnt5a-Frizzled-2通路与脑I/R损伤

缺血性脑卒中，又称缺血性脑血管病(initiated chemical vapor deposition, ICVD)和脑梗死，是一种由脑供血液供应可以改善ICVD的临床结局，但脑I/R损伤会增强脑损伤，引起神经功能缺损、脑梗死、Wnt5a 上调并增加患者的死亡率[24,25]。Wnt5a激活在脑损伤中起关键作用，作为Wnt非规范途径的细胞外配体，通过与质膜受体或共受体复合物结合并激活细胞质中的DVL来调节Wnt非规范途径[26],参与Ca2+新陈代谢。张红梅等[27]研究将冠状面切取大鼠脑片迅速置于2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液中染色后于4%多聚甲醛中固定，在相同视野下，比较大鼠的脑I/R组和假手术组的Fzd-2免疫反应阳性细胞阳性总面积，结果显示蛋白表达的阳性面积比值为(12.32±1.00)×102比(4.04±1.17)×102(P<0.01),即I/R组Fzd-2的蛋白表达高于假手术组，表明Fzd-2的表达在脑缺血再灌注损伤中显著升高，这可能与Wnt5a对Fzd-2的激活有关。通过激活Fzd-2受体从而触发Ca2+释放。牛力军[28]研究证明了这一点：实验利用大鼠海马星形胶质细胞检测Fzd-2蛋白质的表达和Wnt5a-Frizzled-2通路的活性，通过qRT-PCR的检测结果发现脑损伤后海马组织中Wnt5a和Fzd-2基因的表达分别达到正常组的7倍和6倍，Western blot 法检测结果中Wnt5a和Fzd-2蛋白表达分别升高2倍和5倍(P<0.01),另外分离伤侧海马组织细胞进行FLuo-3AM孵育，发现细胞中Ca2+荧光强度升高1.83倍(P<0.01),结果表明Wnt5a-Frizzled-2通路在脑损伤后会被激活，并且介导了神经细胞中钙超载的发生，从而参与了脑细胞的凋亡。另外，有研究在体外和体内评估了Wnt5a-Frizzled-2在大鼠海马细胞中的表达，体外实验中细胞内Ca2+的荧光强度比细胞内Ca2+的指示剂Fluo-3/AM显著提高了1.75倍(P<0.01),而使用Stealth RNAi阻断Fzd2信号传导后，转染细胞中Wnt5a基因和蛋白的表达分别降低200%和400%(P<0.01),同时细胞内Ca2 +的表达降低150%(P<0.01),另外体内实验中创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)时Wnt5a/Fzd2 基因和蛋白表达分别上调了2倍和5倍(均P<0.01),并且细胞内Ca 2 +在离体损伤海马细胞中增加，这些结果表明TBI可以显著增加细胞内Ca2+的水平，Wnt5a-Frizzled-2信号通路参与了TBI时神经细胞内Ca2+的增加[29]。综上所述，Wnt5a-Fzd-2信号通路是脑I/R的重要靶点，为脑外伤后的治疗提供了有利证据。对于Fzd-2的过表达激活Wnt5a/Frizzled-2途径诱导Ca2+的积累的效应可以通过抑制Fzd-2来逆转。

已经发现Wnt通路与Notch通路存在于同一个调节网络中，在脑损伤发生时，Notch1通路的激活可以激发出神经干细胞(neural stem cells, NSC)更强的增殖分化潜能，从而有利于受损后脑组织的修复，并且在调控血管生成时，Fzd-2是Wnt通路与Notch通路共同的调控因子[30]。Notch1通路在脑缺血和缺氧中被激活，并对神经细胞有保护作用，有研究以成年雄性大鼠大脑中动脉闭塞再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion, MCAO/R)和原代海马神经元氧-葡萄糖剥夺再氧合(oxygen-glucose deprivation and reoxygenation, OGD/R)分别作为体内和体外I/R损伤模型进行远程缺血预处理(remote ischemic preconditioning, RIPC),再灌注后24 h后使用(triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色，与MCAO/R组相比，RIPC+MCAO/R组的梗死体积减少了40.2%(P<0.01),另外用神经元核抗原(neuronal nuclei antigen, NeuN)/原位末端标记(TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)法观察RIPC对MCAO/R后大鼠海马神经元凋亡的影响，用TUNEL和NeuN双免疫荧光染色代表细胞凋亡率，研究发现，与MCAO/R组相比，MCAO/R损伤增加了海马区NeuN/TUNEL阳性细胞的数量，而RIPC显著下调了该细胞的比例，然而通过脑室内途径给予大鼠Notch1通路抑制药DAPT减弱了RIPC抗凋亡作用(P<0.01),表明Notch 1通路在RIPC时对神经细胞起着重要保护作用，减少神经元凋亡[31]。 此外，RIPC激活NF-κB通路，从而增强该蛋白在神经元中的DNA结合活性，提高脑组织对I/R损伤的耐受性。NF-κB基因是Notch 1信号通路的下游靶基因之一，Notch 1信号通路通过影响NF-κB依赖性靶基因的表达，进而通过调节kappa B 抑制因子激酶(inhibitor of kappa B kinase, IKK)影响NF-κB的表达，从而在脑I/R损伤中起到保护作用[32,33]。同时，前文提到Wnt5a-Frizzled-2通路可通过升高细胞内Ca2+浓度从而激活NF-κB,因此，Wnt5a-Frizzled-2通路可能与Notch1通路存在某种联系，通过此种联系可能会抑制Wnt5a-Frizzled-2通路的激活、促进Notch1通路的激活来减少神经细胞凋亡的发生，从而为脑I/R治疗提供一个全新的方向。

3、讨论

Wnt5a-Frizzled-2通路在心脏和脑等器官发生I/R损伤时会被激活，激活后可以通过多种机制引起钙超载，诱发细胞凋亡。Wnt5a-Frizzled-2通路的研究提示可以通过抑制该通路的激活，降低细胞内钙超载、减少缺氧/复氧，从而减少心肌细胞凋亡，为阻断I/R损伤发挥作用。由于在脑缺血疾病及其治疗中，同时存在Wnt5a-Frizzled-2通路与Notch1通路的激活，且Wnt通路与Notch通路存在一定的交叉，由此引发我们对于治疗脑I/R损伤思路的设想，但是两通路具体通过怎样的机制发生交互尚未研究清楚，而明确Wnt5a-Frizzled-2通路的机制以及该通路与其他通路的联系对于抑制I/R损伤的发生和临床治疗I/R对人体器官的损伤有重要意义。

参考文献:

[1]张弛.神经肽Y调控成骨和破骨分化与Wnt信号通路相关的机制研究[D].广东广州:暨南大学,2018.

[8]程建勇.WNT信号通路受体家族Frizzleds对猪卵母细胞体外成熟的影响[D].陕西咸阳:西北农林科技大学,2017.

[9]申震,朱付平,黄勇,等.Wnt/Ca2+信号通路在肢体缺血/再灌注损伤机制中的研究进展[J].中国药理学通报,2018,34(10):1344—1347.

[10]孔令恒,顾晓明,南瑛,等.钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93加重大鼠离体心脏钙超载损伤[J].中国药理学通报,2016,32(6):832—836.

[11]李航兵,赵夏洁,尹金玲,等.蛋白激酶C信号通路在脑缺血-再灌注损伤中作用[J].脑与神经疾病杂志,2016,24(2):120—122.

[15]周珊珊.Wnt-5a/Frizzled-2途径对心肌缺血再灌注损伤后心肌Ca2+变化的影响的研究[D].广东广州:南方医科大学,2011.

[16]刘丹勇,夏正远,韩荣辉,等.心肌缺血再灌注损伤机制研究的回顾与展望[J].中国动脉硬化杂志,2020,28(12):1013—1019.

[27]张红梅,胡建鹏,王键,等.局灶性脑缺血再灌注大鼠额顶叶脑皮质Notch3､Notch4､Frizzled2和Tead1蛋白表达的变化 [J].中华医学杂志,2015,95 (46):3766—3769.

[28]牛力军.Wnt5a/Frizzled-2途径在神经细胞中的作用以及脑损伤后其激活对神经细胞钙离子超载的影响研究[D].广东广州:南方医科大学,2012.

基金资助:国家自然科学基金青年基金资助项目(81703490); 山东省医药卫生科技发展计划基金资助项目(202002061311); 济宁医学院教师科研扶持基金资助项目(JYFC2019KJ013);济宁医学院大学生创新训练计划基金资助项目(cx2021140);

文章来源:孙志鹏,董树素,马川程,等.Wnt5a-Frizzled-2通路与缺血再灌注损伤的研究现状[J].中国临床药理学杂志,2024,40(13):1972-1976.