人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)导致的获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)，即艾滋病，是严重威胁人类生命健康的全球性疾病，主要破坏人体内CD4+T淋巴和单核-巨噬细胞从而导致免疫功能衰竭，引起各种机会性感染或肿瘤的慢性高致命性传染病[1]。自1996年高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)问世已有20多年历史，但在临床上艾滋病至今仍然无法治愈，其中一个重要原因就是HIV-1仅仅对人类及类人猿具有感染性及致病性，缺乏理想的动物疾病模型来揭示HIV-1潜伏感染导致AIDS的分子机制，这极大阻碍了HIV-1感染的预防性疫苗和新型治疗药物方面的突破性进展[2-3]。

猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)感染非人灵长类动物来建立体内动物感染模型，在研究HIV-1潜伏库中存在明显的优势，可同时对动物多器官多系统进行研究，且病毒感染引起的免疫反应与人类十分类似[4]。但SIV与HIV-1基因组序列相似性仅有40%，遗传差异较大，从而使得SIV不能直接代替HIV-1用于HIV/AIDS的研究，并且非人灵长类动物模型成本较高、周期较长，也使此类模型在HIV/AIDS的研究中没有得到广泛的应用[5-7]。近年来，小鼠作为动物模型备受重视，因为鼠类动物存在体型小、成本低廉、饲养简单、方便操作和繁殖迅速等诸多优势，目前已广泛应用于实验室和临床研究。但是由于小鼠细胞本身没有人CD4受体，无法被HIV-1病毒感染，故不能直接用于HIV-1的研究[8]。NOD/Prkdcscid/IL2rgnull (NPG)人源化小鼠模型即在NOD/重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)背景下通过引入白细胞介素-2 (interleukin-2,IL-2)受体蛋白的γ链基因(IL2rg)敲除小鼠，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)，通过移植成熟的人类免疫细胞，包括外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)等，来重建小鼠的免疫系统，该模型因其能模拟天然HIV-1感染人类免疫系统而被广泛应用[9]。

本研究旨在通过尾静脉注射人源外周血PBMCs细胞构建人源化小鼠模型；同时对于人源化成功的小鼠，通过腹腔注射HIV-1 NL4-3-Nano Luc病毒液进行感染，进行活体成像定位和定量病毒的蛋白表达，通过实时荧光定量PCR从分子水平定量HIV感染小鼠模型体内病毒RNA、总DNA及整合前病毒DNA，并初步评估病毒库的大小，可作为HIV药物治疗和细胞治疗的评价模型[10]。

1、材料与方法

1.1 实验动物及细胞

NPG小鼠购自维通达生物技术有限公司，隔离盒饲养于武汉科技大学无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级屏障环境(感染前)及中国科学院武汉病毒研究所生物安全三级实验室(感染后)中，饲料、水、垫料均经高温高压灭菌。小鼠6周龄，实验前适应性饲养；实验注射PBMCs来源于武汉市中心血站中健康人外周血。本文用到的小鼠动物实验经武汉科技大学动物伦理委员会批准，批准号为[SYXK(鄂)2018-0045]。

1.2 试剂和仪器

人淋巴细胞分离液、Furimazine及红细胞裂解液购于北京索莱宝科技有限公司；RPMI l640细胞培养液购于Hyclone公司；阿巴卡韦(ABC)和雷特格韦(RAL)购于Med Chem Express公司；Lenti-X p24快速滴度试剂盒购于Ta Ka Ra公司；抗人CD45-PE、CD3-APC、CD4-FITC、CD8-pacific Blue抗体购于BD公司，并使用BD公司流式细胞仪进行检测；实时荧光定量PCR法试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。荧光定量PCR仪购于Bio-Red公司；落地式水平离心机由Eppendorf公司生产；小鼠组织研磨器购于北京天根生化科技有限公司；小动物活体光学成像系统购于Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 人外周血单核细胞(PBMCs)的分离

采自武汉市中心医院健康人的静脉血，肝素钠抗凝后，于室温下650×g离心15 min，去上层血浆，下层血细胞用等体积生理盐水稀释，颠倒混匀后，轻轻加入已经铺好的淋巴细胞分离液(Ficoll)中，室温650×g离心30 min。轻轻吸取单个核细胞(白膜层)加入3倍体积生理盐水清洗一次，室温300×g离心10 min。离心后加入红细胞裂解液10 m L重悬，静置5 min至液体澄清。后补加PBS至45 m L，室温450×g离心10 min，使用生理盐水重悬人PBMC细胞至2.5×107cells/m L。

1.4 Hu PBMC-NPG人源化小鼠的构建及流式检测

该部分实验于SPF级动物房中完成。具体实验方式为：选取合适的6周龄NPG小鼠经过适应性培养3 d后，分为4组，每组各5只，保持4组小鼠在体重、状态等相对一致。在SPF级屏障环境中，给予4组小鼠尾静脉注射5×106cells/只人PBMC进行人源化免疫重建。

PBMC注射小鼠后，分别在第3周和第5周收集小鼠颌下静脉血约150μL/只，EDTA抗凝；加入全血2倍体积的红细胞裂解液，冰上裂解10 min,500×g离心10 min去上清，100μL生理盐水重悬细胞。分别加入人CD45+、CD3+、CD4+、CD8+抗体，4℃染色30 min，洗涤3次后通过流式细胞仪检测小鼠外周血中存活的人淋巴细胞CD45+、CD3+、CD4+、CD8+比例[11]。

1.5 Hu PBMC-NPG人源化小鼠GVHD评分

移植后小鼠每周进行移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)评分，GVHD临床表现包括体重下降、活动度、姿势、耸毛和皮肤溃疡5项，GVHD临床评分由这5项相加组成[12]。

1.6 NL4-3-Nano Luc病毒构建及包装

以本实验室保存的HIV B亚型的表达质粒p NL4-3为骨架，利用Xho I限制性酶切位点，在Env基因和Nef基因间依次插入海肾萤光素酶Nano Luc基因、linker和IRES，从而获得p NL4-3-Nano Luc质粒。在生物安全三级实验室转染HEK293T细胞，72 h后收获上清，分别依次300×g 5 min、3 000×g 30 min和30 000×g 180 min离心获得高纯度的NL4-3-Nano Luc病毒。

1.7 病毒p24蛋白定量、TCID50检测及感染验证

将p24标准品稀释成5个梯度(200、100、50、25、12.5 pg/m L)，以DMEM基础培养基为介质，将病毒上清稀释至10-5和10-6，并设定稀释液为空白对照。根据实验设计在96孔板中确定样品位置，将标准品、样品以及空白对照各200μL加入包被孔中，盖上保护盖。每孔中加入20μL裂解液，并于37℃恒温培养箱中孵育60 min。去上清，用300μL的洗涤液清洗96孔板，并反复清洗5次。每孔中加入100μL的p24生物素偶联抗体，并于37℃恒温培养箱中孵育60 min。去上清，用300μL的洗涤液清洗96孔板，反复清洗5次。每孔中加入100μL的链霉素‐辣根结合物，并于室温(18-25℃)孵育30 min。去上清，用300μL的洗涤液清洗96孔板，反复清洗5次。将100μL的结合底物添加到每个孔洞中，在室温下(18-25℃)避光孵育20 min。孵育完成后，每孔加入100μL终止液(stop solution for TMB substrate)。反应1 min后，将酶标仪的吸收波长设置为450 nm进行测定。对数据进行处理，绘制标准曲线并进行拟合，对细胞培养上清中的假病毒的p24值进行计算并对其进行定量[13]。

取TZM-bl细胞以1×104/孔接种于96孔板中，16 h后轻轻弃去上清。用含有10%FBS和10μg/m L DEAE-dextran的DMEM完全培养基梯度稀释病毒原液，顺序得到稀释梯度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的病毒稀释液各1 m L。每孔加入100μL病毒稀释液，每组10孔，将96孔板置于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。96 h后每孔补充DMEM完全培养基50μL,144 h后每孔补充DMEM完全培养基50μL,168 h后弃上清每孔加入100μL 25μg/m L Furimazine进行荧光检测。当荧光值大于阴性孔的3倍，该孔即为阳性孔，否则为阴性孔。根据记录的各组阳性孔数量和阴性孔数量，采用Reed-Muench两氏法计算公式计算每0.1 m L假病毒原液TCID50值。公式如下：

距离比例=(高于50%阳性率的百分数-50%)/(高于50%阳性率的百分数-低于50%阳性率的百分数)。

lg TCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%阳性率的稀释度的对数。

再根据高于50%阳性率的假病毒稀释液稀释度的对数，计算出每0.1 m L病毒原液的TCID50活性滴度[14]。

1.8 HIV-1小鼠感染模型的鉴定及治疗

此部分实验在生物安全三级实验室进行，NL4-3病毒株是HIV CXCR4趋向的野生型毒株，具备感染人外周血CD4+T细胞的特性[15]。建模5周后，将小鼠分成3组，每组各5只，其中低剂量组2组，腹腔注射每只2×105TCID50的重组病毒和高剂量组1组，腹腔注射4×105TCID50的重组病毒，感染16 d和27 d后以每只150 mg/kg剂量腹腔注射150μL Furimazine成像底物。并以异氟烷气体麻醉小鼠，5 min后使用IVIS小动物活体成像系统(Xenogen,Hopkinton)收集光信号，活体成像的数据用软件Living image (version 4.0)进行标准化处理，光密度强度及定位能反映病毒在动物机体的复制水平及病毒储藏库位点。当荧光信号ROI值达到106-107photons/(s·cm2)即可判定感染模型构建成功。阿巴卡韦(Abacavir,ABC)和拉替拉韦(Raltegravir,RAL)溶解于生理盐水中，对低剂量感染小鼠灌胃给药，剂量分别为150 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)[16]。

1.9 HIV-1感染小鼠脾脏和血液组织病毒DNA、RNA定量

提取感染病毒5周后小鼠的脾脏和血液组织中总DNA和RNA，选取特异性gag引物探针(表1)，通过实时荧光定量PCR的方法(表2、表3)，对感染小鼠脾脏和血液组织DNA中的gag基因的拷贝数进行定量，同时以β-globin作为内参基因，选取特异性β-globin引物探针定量每μL感染小鼠组织DNA中β-globin基因拷贝数，并用于基因拷贝数的归一化处理，计算得到每106组织细胞中gag基因DNA的拷贝数。总RNA经过逆转录(reverse transcription,RT)后，通过实时荧光定量PCR的方法，对感染小鼠脾脏和血液组织RNA中的gag基因的拷贝数进行定量，以人GADPH基因作为内参基因，选取特异性人GADPH引物探针定量每μL RNA浓度，对定量的gag RNA进行归一化处理，计算得到每μg RNA中gag基因RNA的拷贝数。

表1 荧光定量PCR引物和探针

表2 荧光定量PCR反应体系

表3 实时荧光定量PCR反应程序

1.1 0 HIV感染小鼠体内整合前病毒DNA的定量

为了量化小鼠细胞中HIV整合前病毒的拷贝数，我们首先建立了整合标准曲线，并经过两轮PCR扩增，包括第一轮12个循环的线性预扩增(表4)，然后进行巢式实时荧光定量PCR检测。

以本实验室构建Jurkat-EGFP-m Cherry双标细胞的基因组DNA作为HIV的整合标准品，Jurkat-EGFP-m Cherry双标细胞由囊膜gp120缺陷的HIV NL4-3质粒和水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV-G)囊膜质粒共转染包装假病毒感染，该假病毒感染细胞后无法复制产生子代病毒，经细胞传代20代后，非整合HIV基因组拷贝被极大稀释而拷贝数极低，提取20代后的细胞基因组总DNA，选取gag区引物探针及标准品对该整合HIV基因组标准品进行绝对定量，定量后作为检测HIV-1前病毒整合的标准品[17]。

从整合HIV基因组DNA浓度为105拷贝数/µL的标准品起始，连续10倍稀释，同时加入未感染细胞的基因组DNA，保证各个浓度梯度标准品DNA总浓度大致相同，确保各个浓度的扩增效率一致。首先在第一轮12个循环预扩增中，整合标准品加入人宿主细胞基因组锚定引物Alu-F和HIV特异性引物LTR-R (表1)，待测样品定量组加入Alu-F和LTR-R，待测样本对照组仅加入LTR-R。利用HIV第12对引物探针对于第一轮预扩增产物进行绝对定量，以整合标准品作为标准曲线分别待测样品定量组和对照组的拷贝数，然后每管待测样本的整合拷贝数等于待测样本定量组减去待测样本对照组的拷贝数，同时根据已经测定的每µL β-globin基因拷贝数进行归一化处理，计算得到每106细胞中HIV整合前病毒DNA的拷贝数。

表4 第一轮预扩增PCR反应程序

1.11统计学方法

采用Graph Pad Prism 8统计学软件对实验数据进行分析。呈正态分布的计量数据以均值±标准差(±s)表示；组间及多组的两组间数据比较采用Student’t检验。P<0.05表示差异有统计学意义，*：P<0.05;**:P<0.01;***P<0.001。

2、结果与分析

2.1 NL4-3-Nano Luc病毒表达质粒构建及包装病毒感染性验证

以本实验室保存的HIV B亚型表达质粒p NL4-3为骨架，成功构建p NL4-3-Nano Luc质粒(图1A)。酶联免疫吸附反应检测包装病毒的P24蛋白含量，绘制标准曲线，测得包装病毒原液P24蛋白含量为1.8×107pg/m L，检测病毒活性滴度TCID50为10-6.74/0.1 m L (图1B)。通过萤光素酶系统检测，成像结果证明包装的病毒具有感染TZM-bl细胞的能力(图1C)。

2.2 NPG小鼠模型体内人源细胞检测

在PBMC注射建模后第3周和第5周，通过颌下静脉采血、裂解红细胞得到小鼠外周血单核细胞，再经过h CD45/CD3/CD4/CD8多色标记抗体染色和流式细胞仪分析，结果表明，人PBMC建模3周和5周后h CD45+阳性的人源细胞在小鼠外周血中的比例分别为47.9%和83.5%，均满足人源细胞占比大于25%的标准(图2A),5周后h CD3在h CD45+细胞群中占比达到98.7%(图2B)。在CD3+T细胞群中表达CD4+和CD8+阳性细胞各占27.5%和65.2%，在这群细胞中除了CD4+和CD8+单阳性T细胞，CD4+CD8+双阳性T细胞的比例为6.28%。以上结果证明通过尾静脉注射人PBMC后，人源细胞在小鼠体内增殖分化，5周后成功构建NPG人源化小鼠模型，可以开始HIV-1小鼠感染模型的建立。

图1 NL4-3-Nano Luc病毒表达质粒构建、病毒包装及其感染性验证

图2 人源化小鼠外周血h CD45+/h CD3+/h CD4+/h CD8+T细胞比例分析

2.3 HIV感染小鼠模型的构建

小鼠人源化建模及鉴定实验设计见图3A，待小鼠外周血中h CD45+T细胞超过25%时，通过腹腔注射NL4-3-Nano Luc病毒液进行感染，感染当天，HAART治疗组小鼠开始灌胃给药，每天2次，间隔12 h。人源化小鼠在感染后第16天和第27天进行小动物活体成像检测HIV病毒在体内分布和病毒复制水平。低剂量组和高剂量组成像荧光强度随时间延长而呈现增强趋势，均显著高于HAART治疗组(图3B)。HAART治疗组成像荧光强度随着药物治疗时间延长而降低，表明临床抗病毒药物同样能够高效抑制HIV在小鼠体内的复制。小鼠感染27 d后，低剂量组和高剂量组荧光信号ROI值达到106-107photons/(s·cm2),HIV病毒携带标签萤光素酶蛋白表达与病毒的复制水平和在小鼠体内的分布直接相关[18](图3C)。以上结果表明，从低剂量组、高剂量组和HARRT治疗组的萤光素酶表达证明HIV-1病毒能成功感染人源化小鼠模型，且病毒感染水平与起始接种剂量呈正相关。同时从注射PBMCs后，每周对人源化小鼠进行体重监测(图3D)和GVHD评分(图3E)，结果表明在整个人源化和建立病毒感染模型及抗病毒检测的实验过程(9周)中，小鼠未出现明显GVHD。

2.4 实时荧光定量PCR定量小鼠体内病毒载量

在NL4-3-Nano Luc病毒感染27 d时，对小鼠脾脏组织的HIV-1总DNA和RNA水平进行实时荧光定量PCR测定，图4A为扩增曲线，图4B为标准曲线，该方法定量范围为101-106copies/μL样本。结果显示，未感染对照组扩增后无荧光信号产生，低剂量感染27 d后人源化小鼠脾脏组织中病毒DNA拷贝数达到18 000 copies/106cells,RNA拷贝达到20 000 copies/μg，低剂量感染并经HARRT治疗组小鼠脾脏组织病毒DNA比未治疗组降低了93.6%，病毒RNA表达降低了98.6%；其外周血中病毒DNA降低了70.9%,RNA表达降低了96.5%，而在高剂量组病毒DNA拷贝数为35 000 copies/106cells,RNA表达为32 000 copies/μg (图4C、4D)。以上分子病毒学检测结果表明HIV病毒能有效感染人源化小鼠，且体内病毒表达水平具有剂量依赖性，同时，HAART治疗能够大大抑制小鼠体内病毒复制。

图3 HIV感染人源化小鼠模型成像

图4 HIV-1病毒总DNA、RNA定量标准曲线及人源化小鼠病毒定量

2.5 HIV整合前病毒DNA测定方法建立及定量

HIV-1病毒基因组整合到宿主细胞染色体中是病毒生命周期的重要步骤，整合后形成的潜伏病毒库是HIV-1感染不能被治愈的最大影响因素。定量整合前病毒水平，可作为间接评价抗病毒治疗是否有效减少病毒库规模最有效的方法。本实验室建立了nested-q PCR方法用于测定整合前病毒量，包括：(1) Jurkat-EGFP-m Cherry双标记细胞系构建及整合标准品制备；(2)标准品及待测样本的12个循环的预扩增；(3)所有预扩增产物荧光PCR再定量(图5A、5B)，实验设计(图5C),Alu-F和LTR-R双引物预扩增曲线及LTR-R单引物单向扩增曲线(图5D)。

图5 HIV-1整合前病毒DNA定量方法建立

HIV整合前病毒标准品荧光定量扩增曲线见图6A，绘制标准曲线(图6B)，该方法能够准确定量范围为101-105copies/μL。在HIV-1(NL4-3-Nano Luc)病毒感染27 d时，对小鼠脾脏组织的HIV-1整合前病毒DNA拷贝数进行nested-q PCR测定，结果显示，阴性对照组无荧光信号产生，低剂量感染HIV-1 27 d后人源化小鼠脾脏组织中整合病毒基因组DNA达到1 500 copies/106cells，而在HAART治疗后，脾脏组织中整合前病毒载量降低了74.4%，血液组织中整合前病毒载量降低了88.1%(图6C)，同时，与总DNA和总RNA定量结果一致，脾脏和血液组织内整合前病毒载量也与感染剂量呈正相关。对脾脏组织中的总DNA、总RNA及整合前病毒DNA进行综合分析，结果表明HARRT治疗组可以显著降低总DNA/integrated DNA和总RNA/integrated DNA的比例(图6D)。说明HARRT治疗可以同时降低病毒整合水平和HIV RNA表达水平，结果与临床HIV-1感染的HARRT结果高度一致，进一步验证了该HIV感染动物模型能有效模拟HIV感染者体内的抗病毒机制。

图6 HIV-1整合前病毒DNA定量标准曲线及人源化小鼠脾脏和血液中病毒整合DNA定量

3、讨论与结论

长期以来，缺乏可用于体内测试HIV-1感染的小动物模型是制约HIV-1研究的一大障碍，而选择非人灵长类动物作为动物模型成本较高、周期较长，这大大限制了对艾滋病相关疾病机制与疫苗开发的研究[19]。由人PBMC衍生的人源化小鼠模型为HIV感染的病理研究及治疗提供了新的有效途径。NPG小鼠模型是将获得的IL2RG基因敲除小鼠，回交到NOD-SCID背景建立的T细胞、B细胞以及NK细胞缺失的高度免疫缺陷模型，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷[20-22]。NPG小鼠是迄今世界上免疫缺陷程度最高的工具小鼠，且与NOD-SCID小鼠相比寿命更长，平均长达1.5年；移植各类外源性细胞，较少发生排斥反应及移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)，以及无B淋巴细胞泄漏现象[23-24]。

近年来HAART治疗可使感染者血浆中HIV-1 RNA降至常规方法检测限度以下，只有用敏感度更高的方法才可检测到病毒基因和低水平的病毒复制，这使得HIV RNA检测也表现出极大的局限性，不能检测出HIV RNA并不意味着体内病毒库已被清除。本研究应用Taq Man荧光定量PCR技术定量感染小鼠组织中病毒DNA、RNA及整合前病毒水平，灵敏度最低可达1 copies/μL。同时HIV潜伏性病毒“储藏库”，存在于静息的中枢记忆CD4+T淋巴细胞中。HIV病毒感染细胞内的HIV-1 DNA存在形式是多样的，包括线性非整合的、1-LTR环状的、2-LTR环状的和整合的，其中整合的HIV-1 DNA只占总DNA的很少一部分(可到4%)，然而整合HIV前病毒基因组具有高转录活性，是病毒储藏库的主要存在形式，一旦停药，病毒会迅速反弹[25-26]。目前较多的文献报道仅仅利用real-time PCR的方法来定量HIV-1总DNA并以此来判定病毒储藏库的含量，该方法检测结果包含多种形式的HIV-1 DNA，因此对基因组中的HIV“储藏库”的定量是不准确的[27-28]。本研究建立了一种快速定量检测整合HIV前病毒基因组的方法，优选引物和探针基因型，具备覆盖率高、保守性高、特异性强等优点，能显著区分基因组中整合的病毒DNA与非整合的病毒DNA。

本研究通过尾静脉注射人PBMCs构建人源化小鼠嵌合模型，并通过测定小鼠外周血中h CD45+的占比来判定人源化的成熟度，在小鼠人源化建模过程中，建模3-5周后小鼠外周血h CD45+细胞比例随时间持续上升，在第5周时，h CD45+占比最高可达83.5%,h CD4+和h CD8+最高分别达到8.5%和77.6%，在CD3+T细胞群中，有13%的T细胞同时表达CD4+和CD8+，即双阳性(double positive,DP)表型T细胞，该双阳性表型T细胞能否被HIV感染及其产生的分子机制有待进一步研究[29-30]。通过对所有人源化小鼠的建模数据表明，85%小鼠外周血中h CD45+占比均大于25%，充分说明Hu PBMC-NPG/SCID人鼠嵌合模型具备较高的建模成功率。另外，本研究后续会对建模注射PBMCs剂量及注射方式进行优化，缩短人源化建模的时间，同时也会通过组织中免疫荧光分析人源细胞的分布和免疫表型。随后，本研究采用带有Nano Luc萤光素酶标签的实验室经典毒株NL4-3用于建立感染模型。在同等表达水平下，Nano Luc萤光素酶与传统的萤火虫萤光素酶相比信号强度提高150倍，这为精准定位和定量低水平HIV复制提供了可能[31]。HIV感染16 d后，通过成像发现病毒首先定位在脾脏和颈部深层淋巴结及腹腔，感染27 d后，成像结果表明病毒已扩散到小鼠全身，包括脑部。本实验不足之处在于，应该解剖小鼠后对各个组织进行单独成像，这样可以精准定位人源细胞在各种组织中的分布和病毒载量。实时荧光定量PCR技术和nested-q PCR技术定量结果表明，治疗HIV感染的药物对于HIV感染的小鼠同样有效，同时还说明小鼠体内HIV感染能成功整合到人源细胞的染色体中并完成转录，结合小动物活体成像技术观察到病毒相关萤光素酶蛋白表达，说明转录后萤光素酶基因能正常表达，这些结果充分证明，通过腹腔注射HIV病毒可成功感染该人源化Hu PBMC-NPG/SCID小鼠模型。本研究还存在科学问题有待进一步解决，例如，人源化小鼠体内CD4+和CD8+T细胞的比例为0.42，而在正常人免疫系统中，CD4+和CD8+的比例在1.4-2.5之间。另外，CD4+和CD8+T双阳性细胞形成机制及能否被HIV感染、病毒感染是否会造成CD4+T细胞的损耗仍需进一步研究。

由于小鼠和人类的物种差异较大，异种基因环境下人HSCs的发育、存活、活化和迁移分子不充分等因素导致人源化小鼠模型具有一定的局限性[32-35]。在过去的数十年中，新型基因工程技术用于人源化小鼠的研究进展突飞猛进，人源化小鼠更易操作、更具有经济价值，成为人类健康和疾病临床前期研究的重要模型系统，未来人源化小鼠模型将更多应用于高特异性有效的临床前期实验中，解决人HSCs在小鼠体内的生物活性将是重中之重。

综上所述，本研究利用人外周血单核细胞通过静脉注射方式植入NPG小鼠可成功建立人源化小鼠契合模型，人源细胞成功在小鼠体内增殖和分化，使不被感染小鼠转变为对HIV-1易感并建立稳定的感染。同时，在整个人源化和建立病毒感染模型及抗病毒检测的实验过程中(9周)，小鼠未出现明显GVHD，该模型为研究HIV病毒感染的免疫学机制和抗病毒治疗效果评价提供了有力工具，特别是为开创性的抗HIV CAR-T免疫细胞疗法和基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因治疗提供动物药效评估平台[36-39]。另外，本研究建立的精准定量HIV整合前病毒的方法也为评估体内病毒库的载量大小提供了理论依据。

基金资助:国家科技重大专项(2017ZX10202102-007); 湖北省自然科学基金(2019CFB529); 湖北省技术创新重大专项(2019ACA168)~~;

文章来源:高阳,刘嘉睿,王长俊,等.HIV-1感染小鼠动物模型建立及体内整合前病毒定量分析[J].生物工程学报,2024,40(07):2195-2210.