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KDM6B及FOXO1在浆液性卵巢癌组织中的表达及临床意义

2024-06-12 22 上传者：管理员

摘要：目的:探讨赖氨酸特异性去甲基化酶(lysine [K]-specific demethylase 6B,KDM6B)和叉头框蛋白O1(forkhead box protein O1,FOXO1)在浆液性卵巢癌(serous ovarian cancer, SOC)中的表达水平及其与患者临床病理特征和预后的关系。方法:纳入我院妇科2018年04月至2023年04月收治入院接受手术治疗并经过病理证实的367例SOC患者和150例卵巢良性肿瘤患者。采用免疫组织化学法检测KDM6B、FOXO1蛋白在SOC组织中的表达水平，并分析二者表达水平与临床病理特征的关系。应用Pearson相关系数分析SOC组织中KDM6B与FOXO1蛋白表达的相关性。利用Kaplan-Meier法和Log-rank检验对不同KDM6B、FOXO1蛋白表达水平的SOC患者预后的差异进行比较。结果:KDM6B与FOXO1蛋白SOC组织中高表达率分别为48.77%和53.13%,显著高于正常卵巢组织的21.33%和32.00%(P均<0.05)。不同KDM6B蛋白表达水平的SOC患者在年龄、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、FIGO分期的差异具有统计学意义(P<0.05),FOXO1蛋白表达水平与患者肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、FIGO分期有关(P<0.05)。SOC组织KDM6B与FOXO1蛋白表达呈正相关(r=0.668,P<0.05)。KDM6B、FOXO1蛋白高表达者的总生存率和无进展生存率均显著低于低表达者(P<0.05)。结论:KDM6B、FOXO1蛋白在SOC组织中高表达，二者表达水平呈正相关，且KDM6B、FOXO1蛋白高表达者预后较低表达者更差，提示二者均可能在SOC发生发展中发挥促癌作用，且可作为影响SOC患者预后的关键因素，可能是潜在的SOC早期诊断和预后评估标志物。

关键词：
FoxO1
KDM6B
叉头框蛋白O1
浆液性卵巢癌
赖氨酸特异性去甲基化酶
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卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均居女性恶性肿瘤的第8位[1,2]。2020年全世界范围内卵巢癌新发病例约31.4万，死亡病例约20.7万[3]。上皮性卵巢癌是卵巢癌中死亡率最高的一种类型，根据组织学类型不同可分为浆液性癌、黏液性癌、子宫内膜样癌、透明细胞瘤、Brenner肿瘤及未分化癌等，其中以浆液性卵巢癌(serous ovarian cancer, SOC)最常见[4]。因卵巢部位比较特殊，位于盆腔的深部，且SOC早期临床表现缺乏特异性，患者首次确诊时往往已处于中晚期，甚至有很大比例的患者伴有远处转移[5]。患者的生存率通常与诊断阶段有关，例如，一部分I期患者5年生存率超过90%,非转移性患者的5年生存率可达75%～80%,而远处转移的患者仅为25%[6,7]。因此，探究SOC早期诊断和预后预测相关生物标志物是卵巢癌临床研究的重点和热点问题。

赖氨酸特异性去甲基化酶(lysine [K]-specific demethylase 6B,KDM6B)基因位于人染色体17p13.1,其结构中含有一个JmjC结构域的去甲基化酶活性中心，JmjC结构域能够特异性识别H3K27位点的三甲基化(H3K27me3)并与之结合，从而介导KDM6B发挥去甲基化修饰作用[8]。正常组织中KDM6B蛋白表达量很低，但在炎症因子、肿瘤因子和线粒体应激等诱导下表达显著增加[9]。前期研究发现KDM6B在多种癌症，如乳腺癌[10]、结肠癌[11]、胰腺癌[12]和黑色素瘤[13]等表达异常，继而发挥抑癌或促癌功能。叉头框蛋白O1(forkhead box protein O1,FOXO1)基因位于人染色体13q14.1,FOXO1被证实在结肠癌[14]、肝癌[15]和前列腺癌[16]中发挥抑癌作用，但其在横纹肌肉瘤[17]和乳腺癌[18]中通常呈过表达。目前，KDM6B、FOXO1蛋白在SOC中表达水平及其临床意义尚不明确。因此，本研究拟通过免疫组化法检测KDM6B与FOXO1蛋白在SOC组织中的表达水平，并分析二者表达水平与SOC患者临床病理特征及预后的关系，以期为SOC早期诊断和预后预测提供新思路。

1、资料与方法

1.1 病例来源

纳入我院妇科2018年04月至2023年04月收治入院接受手术治疗并经过病理证实的367例SOC患者作为病例组。年龄33～75岁，平均年龄(59.61±11.43)岁；双侧肿瘤者269例，单侧肿瘤者98例；229例肿瘤直径<3 cm, 138例肿瘤直径≥3 cm; 肿瘤分化程度为G1-G2者113例，G3-G4者254例；发生淋巴结转移者175例，未发生淋巴结转移者192例；参照国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)分期，Ⅰ期104例，Ⅱ期96例，Ⅲ期151例，Ⅳ期16例。纳入标准：①手术切除标本经组织病理证实为SOC[19];②首次确诊且未接受过放疗、化疗和激素治疗等；③年龄18岁以上。排除标准：①合并其他器官恶性肿瘤；②合并严重的心、肺、肝等重要脏器疾病；③孕妇或哺乳期女性；④临床资料不全者。另外纳入同期住院接受手术切除的150例卵巢良性肿瘤患者作为对照组，年龄35～68岁，平均(57.86±10.88)岁，两组年龄的差异无统计学意义(t=1.602,P=0.110)。本研究已获得我院伦理委员会批准 (批准号LS2023-0728),患者本人或家属自愿签订知情同意书。

1.2 主要试剂

兔抗人KDM6B多克隆抗体(货号：Ab38113)购于Abcam公司，兔抗人FOXO1单克隆抗体(货号：CST 2880S)购于Cell Signaling Technology公司，免疫组织化学(SP法)检测试剂盒(货号：SPN-9001)购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化方法

将手术切除的新鲜SOC组织和正常卵巢组织使用10%甲醛溶液固定，经常规处理石蜡包埋的组织连续切片(4 μm厚度);经二甲苯脱蜡、梯度浓度乙醇水化、高温修复抗原；冷却至室温后PBS缓冲液冲洗加入KDM6B(1∶200稀释)、FOXO1抗体(1∶150稀释)4 ℃孵育过夜。次日PBS缓冲液冲洗后滴加生物素标记的二抗室温孵育；经PBS缓冲液漂洗后每张切片滴加50 μL链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育1 h; 经过DAB显色、复染、乙醇梯度脱水、中性树胶封片后，在显微镜下观察组织切片。

1.4 切片结果判定及评分

KDM6B、FOXO1蛋白主要表达于细胞核，以细胞核呈现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。对每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)进行观察后计数阳性细胞。总评分参照二次计分法，即总评分=阳性细胞比例×细胞染色程度[20]。阳性细胞比例≤5%得0分，6%～25%得1分，26%～50%得2分，51%～75%得3分，≥76%得4分。细胞无染色得 0分，浅黄色得1分，棕黄色得2分，棕褐色得3分。总评分 0～2分评定为阴性，3～6分为低表达，7～12分为高表达。在双盲下由两名高年资病理医师对切片结果进行判定。

1.5 随访

参照卵巢癌诊疗规范(2018年版)[21]制定随访方案，即采取电话访问或门诊复查的方式对SOC患者术后第1～2年每3个月随访1次，第3～4年每6个月随访1次，第5年开始每年随访1次，随访截止时间为2023年08月31日。通过随访获得每位SOC患者总生存期(overall survival, OS)和无进展生存期(progression free survival, PFS)资料，OS定义为自手术之日至患者死亡或随访截止的时间，PFS定义为自手术之日至疾病进展或患者死亡的时间。

1.6 统计学方法

应用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差

表示，两组间比较采用t检验。计数资料以例数n(%)表示，两组间比较采用χ2检验。采用Pearson相关系数分析SOC组织中KDM6B与FOXO1蛋白表达的相关性。应用Kaplan-Meier法和Log-rank检验比较不同KDM6B、FOXO1蛋白表达水平的SOC患者OS和PFS的差异。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 SOC组织和正常卵巢组织中KDM6B、FOXO1蛋白的表达

KDM6B蛋白在367例SOC组织中高表达率为48.77%(179/367),显著高于正常卵巢组织的21.33%(32/150),差异具有统计学意义(χ2=33.192,P<0.001)。FOXO1蛋白在SOC组织中高表达率为53.13%(195/367),显著高于正常卵巢组织的32.00%(48/150), 差异具有统计学意义 (χ2=19.091,P<0.001),见图1。

图1 KDM6B、FOXO1蛋白在SOC组织与正常卵巢组织中的表达(SP×200)

2.2 KDM6B、FOXO1蛋白表达与SOC患者临床病理特征的关系

不同KDM6B蛋白表达水平的SOC患者在年龄、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、FIGO分期上的差异具有统计学意义(P<0.05),而肿瘤部位、肿瘤直径的差异无统计学意义(P>0.05)。不同FOXO1蛋白表达水平的SOC患者在肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、FIGO分期上的差异具有统计学意义(P<0.05),与年龄、肿瘤部位、肿瘤直径的差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 不同KDM6B、FOXO1蛋白表达水平的SOC患者临床病理特征的比较n(%)

图2 KDM6B、FOXO1蛋白在SOC组织中表达的相关性

图3 KDM6B、FOXO1蛋白与SOC患者术后预后的关系

2.4 不同KDM6B、FOXO1蛋白表达水平的SOC患者术后预后的比较

179例KDM6B蛋白高表达的SOC患者1、3和5年OS率分别为85.4%、52.8%和22.2%,而188例低表达者1、3和5年OS率分别为97.0%、71.6%和38.7%,KDM6B蛋白高表达者OS率显著低于低表达者(χ2=15.281,P<0.001,图3A)。195例FOXO1高表达的SOC患者1、3和5年OS率分别为88.6%、59.2%和25.8%,显著低于172例FOXO1低表达者(94.4%、66.2%和35.9%,χ2=5.939,P=0.015,图3B)。 KDM6B、FOXO1蛋白高表达者的PFS率均显著低于低表达者 (χ2=5.460,P=0.019;χ2=4.399,P=0.036,图3C-D)。

3、讨论

作为妇科死亡率最高的恶性肿瘤之一，SOC患者起病隐匿，少数患者会出现阴道出血、排液、腰酸腹痛、尿频或便秘等症状，但是大部分患者被确诊时已到达中晚期，通常伴有广泛的腹腔播散和淋巴结转移[20]。近年来，以紫杉醇联合铂类药物的化疗方案、多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的靶向治疗方案以及肿瘤细胞减灭术的推广应用在很大程度上改善了SOC患者的治疗结局，但患者治疗后生存率仍不乐观[22]。SOC是一种具有高度异质性的疾病，其发生发展是一个涉及多阶段、多步骤、多基因动态变化的复杂过程，包括癌基因激活、抑癌基因失活、表观遗传、基因转录后调控异常等机制[4,5]。寻找简单且有效的早期诊断和预后预测生物标志物，有利于提前发现发病风险高、疾病进展快、预后不良的SOC患者，从而尽早实施针对性的临床干预，最大程度上提高患者生存率，改善治疗效果。

KDM6B是H3K27特异性的组蛋白去甲基化酶，通常在炎症因子、细胞毒性及氧化应激条件下被诱导而表达异常[23]。KDM6B蛋白在霍奇金淋巴瘤和肾细胞癌组织中的表达水平显著增加，并且KDM6B过表达可通过诱导上皮间质转化进而促进乳腺癌的侵袭转移级联过程[10]。KDM6B在肺癌细胞A549中高表达，导致G1期细胞比例降低，并抑制p21 mRNA表达，从而促进细胞增殖[24]。CAO等在前列腺癌中观察到KDM6B过表达，KDM6B表达升高与Gleason评分高、血清前列腺特异性抗原水平低和无复发生存期短有关，其机制为雄激素受体可降低KDM6B的转录，并促进CCND1启动子区发生KDM6B依赖的H3K27me3去甲基化。KDM6B促进前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和细胞周期进展，并抑制细胞凋亡[25]。本研究发现SOC组织中KDM6B蛋白高表达率显著高于正常卵巢组织，且其高表达与患者年龄、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、FIGO分期相关。在卵巢癌中KDM6B可能通过TGF-β1/Smad信号通路调节 TGF-β1的表达来发挥促进肿瘤细胞增殖、转移和上皮间质转化功能，而TGF-β1信号通路抑制剂LY2157299可显著抑制KDM6B的这些功能[26]。

FOXO1蛋白可通过多种翻译后修饰过程如甲基化、磷酸化、乙酰化和泛素化，与PI3K/Akt、MAPK/ERK、Wnt/β-catenin等信号途径相互作用，对肿瘤细胞增殖、凋亡、氧化应激及物质代谢等发挥调控作用[27]。前期研究证实FOXO1蛋白在多种肿瘤中表达异常，例如FOXO1调控PI3K/Akt通路使促凋亡蛋白Bim 表达水平增加，进而诱导肺癌细胞 GLC-82和肝癌细胞Hep3B凋亡[28]。FOXO1通过介导Bim表达上调引起肝癌化疗耐药和远处转移[29]。本研究结果表明KDM6B蛋白在SOC组织中高表达，且其高表达与患者肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、FIGO分期有关。PI3K/Akt通路是卵巢癌发生发展主要信号通路之一，而FOXO1是PI3K/Akt通路下游的关键蛋白，其高表达可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21Cip和p27Kip的表达，引起细胞周期停滞在G1期；亦可抑制FasL表达导致细胞增殖[30]。此外，本研究发现KDM6B、FOXO1蛋白在SOC组织中的表达水平呈正相关，且高表达的SOC患者OS率和PFS率显著低于低表达者。LI等证实KDM6B高表达是原发性肺肉瘤样癌预后不良的独立危险因素[31]。XU等发现在胃癌中KDM6B高表达与TNM分期高、淋巴结转移、低OS率和PFS率正相关[32]。 FOXO1可显著促进卵巢癌细胞株A2780、SKOV3、ES-2、HO-8910和OVCAR-3的肿瘤侵袭、迁移和增殖，且FOXO1高表达与卵巢癌患者转移和不良预后显著相关[33]。然而，本研究未对SOC中KDM6B、FOXO1促进肿瘤细胞增殖、转移以及预后影响等机制进行深入研究，下一步将开展研究对机制问题进行探讨。

综上所述，KDM6B、FOXO1蛋白在SOC组织中通常呈高表达，且与患者临床病理特征如肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、FIGO分期有关。KDM6B、FOXO1蛋白表达水平呈正相关，且二者高表达与SOC患者不良预后有关。可见KDM6B和FOXO1蛋白均可能在SOC发生发展中发挥促癌作用，且可作为SOC患者预后的影响因素。提示KDM6B和FOXO1蛋白具有成为SOC早期诊断和预后评估的生物标志物的潜在价值。

参考文献:

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文章来源:陈玲,孙洪芳,王衍.KDM6B及FOXO1在浆液性卵巢癌组织中的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学,2024,32(13):2415-2419.