红叶野桐Mallotus paxii Pamp.为大戟科（Euphorbiaceae）野桐属Mallotus Lour.植物，主要分布于广西、广东、湖南、湖北等地区。野桐属Mallotus Lour.植物全世界约140种，主要分布于亚洲热带和亚热带地区。我国有36种、11个变种，主产于南部各省区，该属中多种植物具有药用功效，如白背叶的根被用来治疗慢性肝炎等病症，叶被用于消炎止血等[1,2]；粗糠柴的根能去热利湿，用来治疗痢疾、咽喉肿痛和外伤出血等[3,4]；石岩枫根、茎及叶入药，可祛风湿、消肿止痛、治风湿痹痛、偏坠肿痛、跌打损伤、乳痈、口眼喝斜、散血解表[5]。红叶野桐用于清热解毒、收敛止血、消肿和平肝[6]，现代药理研究表明其成分异戊烯基二氢黄酮类衍生物具有较好的抗菌活性[7]。文献研究发现，萜类化合物是野桐属植物的主要化学成分，其中二萜类物质是野桐属植物的主要活性成分，目前该属植物中已鉴定出的二萜类化合物有26种，部分化合物显示了良好的抗炎和抗菌等生物活性[8,9,10,11,12,13,14]。

在前期研究中，课题组发现红叶野桐叶醋酸乙酯部位具有抗炎活性[7,14,15,16]，为进一步充分开发和利用红叶野桐，探寻二萜类抗炎活性物质基础，继续对红叶野桐的醋酸乙酯部位的化学成分进行挖掘，从中分离得到7个二萜类化合物，分别鉴定为17-羟基闭花木-12,15-二烯-2-酮-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（17-hydroxycleistantha-12,15-dien-2-one-3-O-β-D-glucopyranoside,1）、对映-16α,17-二羟基-贝壳衫-3-酮（ent-16α,17-dihydroxykauran-3-one,2）、阿贝苦酮（abbeokutone,3）、对映-16β,17-二羟基阿替生烷-3-酮（ent-16β,17-dihydroxyatisan-3-one,4）、圆叶乌桕素A(triarotundin A,5）、野梧桐新素E(mallonicusin E,6）和2α-hydroxy-19-deoxyjesromotetrol(7）。其中化合物1为新的二萜苷类化合物，命名为红叶野桐苷E。化合物1～5、7为首次从野桐属植物中分离得到，化合物6为首次从该植物中分离得到。体外抗炎活性测试结果表明，化合物3和5对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导RAW264.7巨噬细胞中一氧化氮（NO）产生具有显著的抑制作用，其半数抑制浓度（median inhibition concentration,IC50）值分别为28.21、31.73μmol/L，且无明显细胞毒性，具有潜在的抗炎活性。

1、仪器与材料

1260型半制备HPLC（美国Agilent公司）；2695分析型HPLC（美国Waters公司）；安捷伦6545Q-TOF LC-MS（美国Agilent公司）和Thermo Scientific TM Q Exactive Focus LC-MS（美国Thermo公司）；DRX-400M、600M NMR（瑞士布鲁克公司）；LC-3000 Semi-preparative HPLC（北京创新恒通）；日本岛津UV2550-紫外-可见分光光度计；TENSOR27红外光谱仪（KBr压片法）；J-180型圆二色光谱仪（日本Jasco公司）；SK8200H型超声波清洗仪（上海科导公司）；Rigaku D/max 2500Pc单晶衍射仪（日本理学公司）；JASCO P-2000型旋光计（日本Jasco公司）；Multiskan MK3酶标仪（瑞士Tecan公司）、CO2培养箱（美国Thermo公司）；96孔细胞培养板（美国Corning公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；移液器（德国Eppendorf公司）；台式微量离心机（美国Thermo公司）。薄层色谱、柱色谱用硅胶（青岛海洋化工有限公司），葡聚糖LH-20（瑞典GE Healthcare),RP-C18（加拿大silicycle),MCI（日本三菱化学株式会社）。色谱纯乙腈和甲醇（美国Fisher公司），其余试剂均为AR级。磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（美国Gibico公司）；LPS、MTT、Griess试剂（美国Sigma-Aldrich公司)；地塞米松（批号38633，美国Med Chem Express公司）。

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。

红叶野桐于2021年8月采自广西桂林，由广西中医药研究院黄云峰主任药师鉴为红叶野桐Mallotus paxii Pamp.。植物标本（ID-202108211）存放于广西师范大学化学与药学学院的“药用资源化学与药物分子工程”省部共建国家重点实验室。

2、方法

2.1提取与分离

干燥的红叶野桐茎（19.1 kg）用95%乙醇水浸泡，并在提取罐内加热回流提取3次，每次3 h，提取液通过减压浓缩罐浓缩，得浓缩的粗浸膏（584.0g）。将浸膏用水分散，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到石油醚萃取物（79.2 g）、醋酸乙酯萃取物（111.5 g）、正丁醇萃取物（192.1 g）和水提取物（201.2 g）。

醋酸乙酯提取物（111.5 g）经过大孔树脂柱色谱，使用水-甲醇（70∶30、50∶50、30∶70、0∶100）梯度洗脱，得到Fr.A(16.7 g）、Fr.B(22.4 g）、Fr.C(47.4 g）、Fr.D(11.2 g)4个组分。Fr.B(22.4g）通过MCI柱色谱进行分离，使用水-甲醇（70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、20∶80、0∶100）梯度洗脱，得到6个组份Fr.B.1～B.6。Fr.B.2(4.7g）经Sephadex LH-20柱色谱，用二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱，分离得到Fr.B.2.1～B.2.7。Fr.B.2.4(349.0mg）经半制备型HPLC进行制备纯化（乙腈-水16∶84）得化合物1(tR=22.2 min,4.9 mg）、2(tR=30.2 min,18.4 mg）和3(tR=33.9 min,26.4 mg）。Fr.B.2.5(226.0 mg）经半制备型HPLC进行制备纯化（乙腈-水12∶88）得化合物4(tR=11.6 min,3.7 mg）、5(tR=17.4 min,8.9 mg）、6(tR=23.2 min,11.4 mg）和7(tR=29.9 min,10.2 mg）。

2.2化合物1的酸水解及糖的鉴定

化合物1的酸水解是参照文献报道的方法进行操作[17,18,19]。将化合物1点样在硅胶薄层色谱（TLC）板上，置于装有浓盐酸的密闭容器中，室温HCl蒸气水解30 min，取出薄层色谱板，室温晾至无酸味，将葡萄糖标准品点样在同一硅胶TLC板上，二氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸（3.5∶1.5∶3滴∶3滴）展开，邻苯二甲酸苯胺显色，结果表明化合物1酸水解产物中的糖为D-葡萄糖（Rf值为0.37)[20]。

2.3化合物的抗炎活性筛选

本研究采用LPS诱导RAW264.7细胞建立体外细胞炎症模型对分离得到的化合物活性进行测试，细胞培养和体外NO测定参照本课题组先前报道的方法[13,14]进行。

2.3.1 MTT法测定化合物的细胞毒性实验

将RAW264.7细胞以1×105个/孔、180μL/孔接种在96孔板中。孵育过夜后，用1μg/m L LPS 10μL刺激细胞2 h，把不同浓度的阳性对照和不同浓度的化合物各10μL加入孔板，设定3个复孔。于37℃培养24 h。往每孔里加10μL MTT溶液，在37℃培养4 h。然后弃掉上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡10 min，完全溶解甲臜；计算细胞存活率。

2.3.2 Griess法测定LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO的含量

RAW264.7细胞的培养与“2.3.1”项相同。96孔板换成24孔板，细胞加入体积和加药量体积比原来扩大4倍即可。用LPS(1μg/m L）诱导24 h后，收集细胞培养上清液，按照NO的试剂盒测试步骤进行检测，根据抑制率和浓度的关系计算IC50。

3、结构鉴定

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇等有机溶剂。IRνKmaxBr(cm-1):3 436(-OH),1 632（双键）,1 384(C-O);ECD[λmax (Δε)]:240 (1.4) nm。根据其HRESIMS给出的准分子离子峰m/z 503.261 8[M+H]+(calcd for C26H40O8Na,503.262 1)，并结合分析1H-NMR和13C-NMR数据，可以推断该化合物的分子式为C26H40O8，不饱和度为7。

化合物1的1H-NMR谱（表1）显示在低场区有4个烯氢δH 6.12 (1H,d,J=5.8 Hz),5.55(1H,m)和δH 5.20 (2H,m)，说明有2个双键；1个连氧的亚甲基δH 4.34 (2H,m);1个连氧的次甲基δH 4.64 (1H,s);3个甲基δH 1.31 (3H,s),0.87 (3H,s),0.80 (3H,s)；还有1个葡萄糖端基氢信号δH 4.89 (1H,d,J=7.8Hz)。化合物1的13C-NMR和HSQC谱显示其结构中有26个碳信号，包括1个羰基信号δC 211.2、4个烯烃碳信号（δC 141.8、138.6、121.5和117.5）、1个连氧的亚甲基信号（δC 89.1）、1个连氧的次甲基信号（δC 65.0）、3个甲基信号（δC 29.4、18.3、14.9）和1个葡萄糖信号（δC 104.7、76.4、79.0、72.0、79.4、63.4）。结合分子式，除1个葡萄糖基的碳外，还剩下20个碳，初步推断该化合物为二萜苷类化合物。

分析化合物1的1D和2D-NMR数据，发现化合物的苷元部分与3β,17-dihydroxycleistantha-12,15-dien-2-one[21]一致，确定化合物1为二萜3β,17-dihydroxycleistantha-12,15-dien-2-one的苷类化合物，二者不同之处在于，化合物1多了1个葡萄糖基。根据葡萄糖基端基质子的偶合常数（JH-1′=7.8 Hz）可确定其相对构型为β构型。将化合物1进行酸水解及与对照品比对，确定葡萄糖基绝对构型为D型。在化合物1的HMBC谱中，H-1'与C-3存在相关（图1），表明葡萄糖基连接在C-3位。综合以上分析，确定了化合物1的平面结构（图2）。

化合物1的相对构型通过NOESY谱来确定。由NOESY谱图可知，H-8/H-14/H-19/H-20相关，说明这些氢在同一侧；H-3/H-5/H-9/H-18相关，说明这些氢在另一侧（图1）。为进一步确定化合物1的绝对构型，采取量子化学计算的方法[B3LYP-6-31G(d,p),Me OH]，计算了2种可能的绝对构型的理论CD谱，并分别与实测的CD谱进行比较（图3），确定化合物的绝对构型为3R,5R,8R,9S,10R,14R。综合以上波谱分析，确定化合物1为17-羟基闭花木-12,15-二烯-2-酮-3-O-β-D-葡萄糖苷。经数据库检索发现化合物1为未报道过的新化合物，命名为红叶野桐苷E。

表1化合物1的1H-和13C-NMR数据(600/150 MHz,pyridine-d5)  

化合物2：白色粉末。HR-ESI-MS m/z:321.241 8[M+H]+(calcd for C20H33O3,321.243 0）。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:3.33 (1H,d,J=11.2 Hz,H-17),3.21 (1H,d,J=11.2 Hz,H-17),2.37 (1H,m,H-2),2.01 (1H,m,H-11),1.98 (1H,m,H-13),1.94(1H,m,H-1),1.87 (1H,dd,J=1.9,12.2 Hz,H-14),1.76 (1H,m,H-12),1.50 (1H,d,J=6.5 Hz,H-11),1.42 (1H,m,H-12),1.39 (1H,m,H-5),1.38 (1H,m,H-7),1.37 (1H,m,H-6),1.35 (1H,m,H-1),1.34 (1H,m,H-15),1.31 (1H,m,H-15),1.12 (1H,brd,J=8.3Hz,H-9),1.01 (1H,m,H-14),1.00 (3H,s,20-CH3),0.95 (3H,s,18-CH3),0.92 (3H,s,19-CH3);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:40.5 (C-1),35.0 (C-2),221.0(C-3),48.2 (C-4),55.5 (C-5),22.3 (C-6),42.0 (C-7),44.6 (C-8),57.2 (C-9),39.7 (C-10),20.2 (C-11),27.8(C-12),42.1 (C-13),38.8 (C-14),52.8 (C-15),80.6(C-16),70.5 (C-17),27.7 (C-18),21.4 (C-19),18.2(C-20)。以上数据与文献报道的基本一致[22]，故确定化合物2为对映-16α,17-二羟基贝壳衫-3-酮。

化合物3：白色无定型粉末。HR-ESI-MS m/z:321.242 6[M+H]+(calcd for C20H33O3,321.243 0)。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:3.79 (1H,d,J=11.2Hz,H-17),3.67 (1H,d,J=11.2 Hz,H-17),2.47 (2H,m,H-2),2.06 (1H,m,H-13),1.06 (6H,s,H-18,20),1.03 (3H,s,H-19);13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ:39.4 (C-1),34.1 (C-2),218.2 (C-3),47.3 (C-4),54.4(C-5),21.8 (C-6),41.0 (C-7),44.6 (C-8),55.5 (C-9),38.6 (C-10),18.9 (C-11),26.2 (C-12),45.4 (C-13),37.0 (C-14),52.9 (C-15),81.9 (C-16),66.4 (C-17),27.4 (C-18),21.1 (C-19),17.9 (C-20)。以上数据与文献报道的基本一致[23]，确定化合物3为阿贝苦酮。

图1化合物1的关键COSY、HMBC和苷元的NOESY相关 

化合物4：黄色无定型粉末。HR-ESI-MS m/z:321.242 2[M+H]+(calcd for C20H33O3,321.243 0)。1H-NMR (600 MHz,pyridine-d6)δ:3.58 (1H,d,J=10.9 Hz,H-17a),3.44 (1H,d,J=10.9 Hz,H-17b),2.58 (1H,ddd,J=16.0,12.4,6.9 Hz,H-2a),2.34 (1H,ddd,J=16.0,6.0,3.2 Hz,H-2b),2.02 (1H,m,H-11),1.87 (1H,m,H-14),1.84 (2H,m,H-1,12),1.62 (1H,m,H-13a),1.50 (1H,m,H-13b),1.46 (2H,m,H-6),1.43 (1H,m,H-7a),1.37 (1H,m,H-1),1.35 (1H,m,H-9),1.31 (1H,m,H-5),1.23 (2H,m,H-11,15a),1.16(1H,m,H-7b),1.11 (3H,s,20-CH3),1.10 (1H,m,H-15b),1.08 (3H,s,18-CH3),1.04 (3H,s,19-CH3),0.82 (1H,m,H-14);13C-NMR (150 MHz,pyridine-d6)δ:38.5 (C-1),34.7 (C-2),216.4 (C-3),(C-4),56.1(C-5),20.3 (C-6),39.7 (C-7),33.4 (C-8),51.6 (C-9),37.7 (C-10),24.0 (C-11),33.2 (C-12),24.1 (C-13),28.1 (C-14),53.8 (C-15),74.1 (C-16),69.9 (C-17),26.7 (C-18),22.0 (C-19),13.9 (C-20)。以上数据与文献报道的基本一致[24]，确定化合物4为对映-16β,17-二羟基阿替生烷-3-酮。

图2化合物1的结构 

图3化合物1的实验测定ECD和计算ECD值  

化合物5：白色无定型粉末。HR-ESI-MS m/z:323.258 3[M+H]+(calcd for C20H35O3,323.258 1)。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:5.53 (1H,m,H-6),3.72 (1H,dd,J=11.2,2.6 Hz,H-16a),3.45 (1H,m,H-3),3.43 (1H,dd,J=11.2,9.2 Hz,H-16b),3.20 (1H,dd,J=11.2,2.6 Hz,H-15),1.96 (1H,m,H-10),1.89(1H,m,H-2),1.68 (1H,m,H-7),1.66 (1H,m,H-11),1.65 (1H,m,H-2),1.59 (1H,m,H-1a),1.56 (1H,m,H-1b),1.46 (1H,m,H-12a),1.43 (1H,m,H-8),1.36(2H,m,H-12b,H-14),1.24 (1H,m,H-11),1.12 (3H,s,H-18),1.07 (1H,m,H-14),1.04 (3H,s,H-19),0.91(3H,s,H-17),0.73 (3H,s,H-20);13C-NMR (100MHz,CD3OD)δ:144.4 (C-5),120.1 (C-6),82.8(C-15),77.1 (C-3),63.5 (C-16),47.8 (C-10),41.6(C-4),37.8 (C-13),37.6 (C-14),37.2 (C-8),35.9(C-9),35.2 (C-11),31.7 (C-7),30.1 (C-12),29.6(C-19),29.5 (C-2),26.1 (C-18),20.3 (C-1),18.8(C-17),12.8 (C-20)。以上数据与文献报道的基本一致[25]，确定化合物5为triarotundin A。

化合物6：白色无定型粉末。HR-ESI-MS m/z:321.243 4[M+H]+(calcd for C20H33O3,321.243 0)。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:5.13 (1H,s,H-17),4.97 (1H,s,H-17),4.92 (1H,s,H-16a),4.60 (1H,s,H-16b),4.17 (1H,dd,J=3.2,7.3 Hz,H-14),3.67(1H,dd,J=3.2,11.2 Hz,H-15a),3.51 (1H,dd,J=7.3,11.2 Hz,H-15b),2.44 (1H,m,H-7a),2.39 (1H,m,H-2),2.26 (1H,m,H-2),2.23 (1H,m,H-12a),2.06(1H,m,H-1),1.98 (1H,m,H-7b),1.79 (1H,m,H-12b),1.69 (1H,m,H-6),1.67 (1H,m,H-9),1.63(2H,m,H-11),1.58 (1H,m,H-1),1.52 (1H,m,H-5),1.50 (1H,m,H-6),1.09 (3H,s,H-18),1.02 (3H,s,H-19),0.87 (3H,s,H-20);13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ:37.8 (C-1),34.8 (C-2),217.1 (C-3),47.9(C-4),55.3 (C-5),25.2 (C-6),37.9 (C-7),147.2 (C-8),55.7 (C-9),39.5 (C-10),22.9 (C-11),31.5 (C-12),149.0 (C-13),75.4 (C-14),65.8 (C-15),110.7 (C-16),107.7 (C-17),26.1 (C-18),21.9 (C-19),14.2 (C-20)。以上数据与文献报道的基本一致[26]，确定化合物6为野梧桐新素E。

化合物7：白色无定型粉末。HR-ESI-MS m/z:361.235 1[M+Na]+(calcd for C20H35O3,361.235 5)，分子式为C20H34O4。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:3.59 (1H,ddd,J=11.7,4.9,2.6 Hz,H-2),3.40 (1H,d,J=2.6 Hz,H-3),5.53 (1H,m,H-6),2.00 (1H,ddd,J=12.8,4.7,2.2 Hz,H-10),3.20 (1H,dd,J=8.8,2.6Hz,H-15),3.75 (1H,dd,J=11.0,2.6 Hz,H-16a),3.39 (1H,dd,J=11.0,8.8 Hz,H-16b),0.91 (3H,s,H-17),1.20 (3H,s,H-18),1.00 (3H,s,H-19),0.72(3H,s,H-20);13C-NMR (150 MHz,CD3OD) δ:28.6(C-1),69.5 (C-2),80.2 (C-3),42.4 (C-4),142.7 (C-5),120.8 (C-6),30.3 (C-7),37.3 (C-8),36.0 (C-9),46.7(C-10),31.6 (C-11),35.3 (C-12),37.8 (C-13),37.5(C-14),82.6 (C-15),63.5 (C-16),18.9 (C-17),29.0(C-18),26.0 (C-19),12.9 (C-20)。以上数据与文献报道相符[27]，确定化合物7为2α-hydroxy-19-deoxyjesromotetrol。

4、抗炎活性筛选结果

MTT实验结果表明化合物在试验浓度为50μmol/L时无明显细胞毒性。考察了化合物对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞中抑制NO生成的作用，结果见表2。化合物3和5诱导RAW264.7巨噬细胞中NO生成具有较好的抑制作用，其IC50值分别为28.21和31.73μmol/L，而阳性对照地塞米松IC50值为44.99μmol/L。

表2化合物1～7对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO生成的抑制作用 

5、讨论

本研究从红叶野桐茎的醋酸乙酯部位中分离鉴定了7个二萜类化合物，其中化合物1为1个新化合物。并对上述化合物进行了体外抗炎活性筛选，发现化合物3和5具有潜在的抗炎活性。本研究结果进一步丰富了红叶野桐二萜类化学成分的结构类型，对完善红叶野桐抗炎作用的物质基础具有一定的意义。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献:

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基金资助:国家自然科学基金资助项目(32060097);广西中医药多学科交叉创新团队项目(GZKJ2306);

文章来源:黄艳,侯萍,任晨阳,等.红叶野桐茎中1个新的二萜苷类化合物[J].中草药,2024,55(13):4305-4311.