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骨肉瘤组织中叉头框蛋白M1的表达及其与预后的关系研究

2020-08-06 148 上传者：管理员

摘要：目的:探讨骨肉瘤组织中叉头框蛋白M1(forkheadboxproteinM1,FOXM1)的表达及其与预后的相关性。方法:采用免疫组化SP法分别检测FOXM1在96例骨肉瘤组织和30例骨软骨瘤组织中的表达;分析FOXM1表达情况与骨肉瘤临床病理特征的关系;采用Log-Rank检验及Cox回归分析FOXM1与骨肉瘤患者预后的相关性,并通过Kaplan-Meier法绘制生存曲线。结果:骨肉瘤组FOXM1高表达率高于对照组(P<0.05);骨肉瘤组织中FOXM1高表达与肿瘤临床分期和肺部转移相关(P<0.05);单因素分析显示,FOXM1蛋白高表达、肺部是否转移、临床分期是影响生存预后的独立因素(P<0.05);FOXM1蛋白高表达组的5年生存率为65.15%,低于低表达或无表达组的86.67%,差异有统计学意义(P<0.05);多因素分析显示,FOXM1蛋白高表达、临床分期和肺部转移是影响骨肉瘤患者生存预后的独立危险因素(P<0.05)。结论:FOXM1蛋白在骨肉瘤组织中高表达,与患者的肺部转移及临床分期等病理特征有关,且高表达与较差预后相关。

关键词：
FOXM1
免疫组化
预后
预后指标
骨肉瘤
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叉头框蛋白M1(forkheadboxproteinM1,FOXM1)是叉头框转录因子家族成员之一,具有保守性翼状螺旋DNA结构域,在增殖活跃的胚胎组织中普遍表达,而在终末分化的细胞内表达明显下降[1]。研究表明,FOXM1蛋白与恶性肿瘤的进展、预后、转移、复发均有密切的关系[2]。FOXM1蛋白的高表达与肝癌[3]、食管鳞癌[4]及膀胱癌[5]等肿瘤的不良预后相关,可能成为肿瘤的预后指标。国内尚未见有关于骨肉瘤组织中FOXM1蛋白的表达情况与预后的相关性报道。因此,本研究采用免疫组化测定FOXM1蛋白在骨肉瘤组织和骨软骨瘤组织中的表达,分析FOXM1蛋白的表达与骨肉瘤患者临床特征、生存率和预后的相关性,进而为骨肉瘤的预后提供标记物。

1、资料与方法

1.1一般资料

选择2009年5月至2014年6月在宜宾市第二人民医院骨科手术治疗的原发性骨肉瘤患者96例为研究对象。其中男56例,女40例;年龄16～49岁,平均年龄(19.53±9.72)岁;按组织学类型:普通型(包括成骨细胞型、成软骨细胞型、成纤维细胞型等)62例,毛细血管扩张型20例,小细胞型14例;按骨肉瘤生长部位:股骨远端50例,胫骨近端46例;按Enneking外科分期:Ⅰ期26例,Ⅱ期36例,Ⅲ期34例;有肺转移40例,无肺转移56例。另收集同期手术切除的骨软骨瘤患者组织标本30例作为对照组。男18例,女12例,年龄11～32岁,平均年龄(19.82±8.12)岁,股骨16例,胫骨12例,肱骨2例。两组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1取材方法

观察组:全身麻醉成功后,患肢根部绑气囊止血带,常规消毒、铺巾,不驱血上止血带;取适当切口,逐层切开皮肤、皮下组织、深筋膜,操作过程中严格遵守无瘤原则,暴露肿瘤后,纱布保护肿瘤周围组织;在肿瘤周围正常肌肉组织内分离,保护神经血管,将患肢肿瘤瘤段完全游离;根据术前的测量范围,在肿瘤的安全距离完整切除肿瘤;取股骨/胫骨残端髓腔内软组织和术野周围软组织送术中冰冻,证实无肿瘤残留;用大量双氧水、灭菌注射用水冲洗术野,无水乙醇灭活;松止血带,彻底止血。对照组:以肿瘤为中心切开皮肤和深筋膜;分开并向两侧牵拉瘤体浅面的肌肉,暴露出瘤体表面的滑囊和骨膜;于距瘤体基底至少1cm以上的正常骨膜处,做环形切开;用骨凿在正常皮质处做环形切骨,完整切除肿瘤和其表面的骨膜、滑囊;止血后,冲洗切口,分层缝合,加压包扎。术中取得的肿瘤组织用生理盐水洗净,立即放入液氮中保存,再移至-80℃冰箱中保存。待病理结果确诊后,分别测定组织中的FOXM1蛋白表达。

1.2.2主要试剂

兔抗人FOXM1多克隆抗体购自美国SantaCruz公司,免疫组化SP试剂盒和DAB酶底物显示试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2.3免疫组化

采用免疫组化SP法检测骨肉瘤及骨软骨瘤组织中FOXM1蛋白表达情况,步骤如下:常规切片,烘干、脱蜡、水化,柠檬酸缓冲液高压修复抗原,3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶;滴加一抗4℃过夜,试剂一37℃孵育30min,试剂二37℃孵育30min,常规DAB显色,苏木精复染,PBS返蓝,中性树胶封片,镜检。

1.3结果判定

FOXM1蛋白阳性染色主要定位于细胞质或细胞核,呈棕黄色。在400倍光镜下观察每张切片,选择具有代表性的5个高倍视野进行观察计数,结合染色强度和阳性细胞百分比综合判定。细胞染色强度结果判定:无染色为0分,浅黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分;阳性细胞百分比结果判定:阳性细胞计数<5%为0分;6%～25%为1分;26%～50%为2分;51%～75%为3分;>75%为4分。阳性强度=染色比例×染色强度,0分为阴性;1～4分为弱阳性;5～8分为中度阳性;9～12分为强阳性。阳性强度≥4分为高表达,<4分为低表达或无表达。本研究我们根据FOXM1蛋白表达将所有标本分为高表达组和低表达组。

1.4随访

采用门诊复诊和电话随访。随访截至2018年11月30日,随访时间为3～60个月。总生存期(OS)为手术开始至末次随访或死亡的时间。死亡作为终点事件,失访及生存为截尾数据。

1.5统计学处理

数据分析应用SPSS22.0统计软件处理。骨肉瘤组织和骨软骨瘤组织中FOXM1蛋白表达差异及骨肉瘤组织中FOXM1蛋白表达与临床病理特征的关系采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier分析,两组生存率比较采用Log-Rank检验。采用多因素Cox回归模型分析FOXM1蛋白与骨肉瘤患者预后的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1FOXM1蛋白表达情况

骨肉瘤组织中FOXM1蛋白高表达率高于对照组(P<0.05),见表1。

表1FOXM1蛋白表达情况

2.2骨肉瘤患者FOXM1蛋白表达情况与临床病理特征的关系

骨肉瘤组织中FOXM1高表达与患者性别、年龄、组织学类型、生长部位和肿瘤大小无关(P>0.05);骨肉瘤组织中FOXM1高表达与肿瘤临床分期和肺部转移相关(P<0.05),见表2。

表2FOXM1蛋白表达与骨肉瘤临床病理特征的关系

2.3FOXM1蛋白表达情况与骨肉瘤患者预后的关系

2.3.1单因素分析

随访截至2018年11月30日,随访时间为3～60个月。96例患者术后5年生存率为71.88%。其中死亡病例主要集中在术后36个月内,死因主要为肿瘤复发及远处转移。单因素分析显示,FOXM1蛋白高表达、肺部是否转移、临床分期是影响生存预后的独立因素(P<0.05);FOXM1蛋白高表达组的5年生存率为65.15%,低于低表达或无表达组的86.67%,差异有统计学意义(P<0.05),见表3、图1。

表3骨肉瘤患者预后的Kaplan-Meier单因素分析

图1骨肉瘤组织中FOXM1高表达患者和低或无表达患者的Kaplan-Meier生存曲线

2.3.2多因素分析

将单因素分析有统计学意义的临床分期、肺部转移和FOXM1蛋白高表达3个因素纳入Cox比例风险模型,结果显示:FOXM1蛋白高表达、临床分期和肺部转移是影响骨肉瘤患者5年生存率的独立危险因素(P<0.05),见表4。

表4Cox多因素分析影响骨肉瘤患者预后的因素

3、讨论

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发性骨肿瘤之一,占原发恶性骨肿瘤的20%[6]。骨肉瘤的发病部位多见于长管状骨的干骺端(如膝关节周围及肱骨近端),少见于脊柱、骨盆,以单发病灶常见。临床上主要表现为局部肿胀及疼痛,极少数发生病理性骨折,容易与其他疾病混淆。骨肉瘤具有侵袭力强、转移早且转移率高等特点。随着各种化疗和保肢手术的进展,骨肉瘤患者的生存率已经获得显著的改善,但骨肉瘤患者5年生存率维持在只有70%左右,而已经发生转移的骨肉瘤患者5年生存率更低[7,8]。因此,寻找一种生物标志物可对骨肉瘤患者预后进行准确评估并运用其指导治疗是骨科和肿瘤科医生亟待解决的重要课题。

叉头框蛋白M1(forkheadboxproteinM1,FOXM1)是胚胎进化过程中一个转录因子,其在维持细胞增殖与凋亡的动态平衡中发挥着重要作用[9]。FOXM1作为细胞周期的关键因子,可调控多种细胞周期相关基因,还可与多种分子信号通路产生交叉作用。FOXM1的功能缺失使得细胞分化受到抑制,最终导致了分化不良细胞的恶性转变[10]。FOXM1高表达在肿瘤的发生发展、迁移侵袭、血管生成与肿瘤细胞耐药中扮演着重要角色,并与恶性肿瘤的预后密切相关[11,12,13]。目前已经发现在肝癌[2]、食管癌[3]和膀胱癌[4]等多种恶性肿瘤组织中呈高表达。研究报道,FOXM1在骨肉瘤组织中呈高表达,并与骨肉瘤的恶性程度呈正相关[14,15]。颜世举[16]等研究报道,在骨肉瘤细胞中抑制FOXM1的表达后能够使细胞的增殖发生阻碍。彭贻龙[17]等研究报道,骨肉瘤中FOXM1基因的异常高表达能够促进肿瘤病灶内细胞的增殖和侵袭。本研究结果显示:骨肉瘤组织中FOXM1蛋白高表达率高于对照组(P<0.05);骨肉瘤组织中FOXM1高表达与患者性别、年龄、组织学类型、生长部位和肿瘤大小无关(P>0.05);骨肉瘤组织中FOXM1高表达与肿瘤临床分期和肺部转移相关(P<0.05)。结果提示,高表达的FOXM1能够通过影响增殖相关基因的蛋白、促进病灶内细胞的增殖来参与骨肉瘤的发生发展。

在骨肉瘤的病理进程中,肿瘤细胞的异常增殖和侵袭是重要的病理特征,是影响预后的重要原因[17]。基质金属蛋白酶(MMPs)降解细胞外基质ECM,是肿瘤细胞浸润及转移的关键[18]。在MMPs中最重要的基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinases-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinases-9,MMP-9),两者可通过降解基质膜胶原Ⅳ促进肿瘤细胞侵袭转移[19,20]。研究报道,在胰腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中可下调FOXM1的表达来调控MMP-2及MMP-9,从而降低其肿瘤细胞的侵袭转移能力[21,22]。Wu等[23]研究报道,FOXM1过表达与非小细胞肺癌患者不良预后和转移相关,与肺癌细胞的体外侵袭转移能力相关。Salhia等[21]研究报道,在骨肉瘤组织中FOXM1阳性表达水平与MMP-2、MMP-9表达水平呈正相关,且FOXM1阳性表达水平越高预后越差。本研究单因素生存分析显示:FOXM1蛋白表达、肺部是否转移、临床分期是影响总生存预后的独立因素(P<0.05);FOXM1蛋白高表达组的5年生存率为65.15%,低于低表达或无表达组的86.67%,差异有统计学意义(P<0.05);Cox多因素分析显示:FOXM1蛋白高表达、临床分期和肺部转移是影响患者5年生存率的独立危险因素(P<0.05)。结果提示,FOXM1蛋白的高表达可能是骨肉瘤癌细胞向周围组织浸润及侵袭转移的促进因素,其是骨肉瘤潜在预后生物标志物和治疗靶点。

综上所述,FOXM1蛋白在骨肉瘤组织中高表达,同时与骨肉瘤患者的肺部转移、临床分期等病理特征及生存预后有关。因此,FOXM1蛋白可能是骨肉瘤患者筛查、治疗及预测预后的重要靶标。由于本研究条件所限,本研究样本量偏少,可能导致结果偏倚,对FOXM1蛋白与骨肉瘤临床病理特征及预后的关系研究还有待于多中心、大样本的研究。

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吴小军,谢小平.叉头框蛋白M1在骨肉瘤组织中的表达及其与预后的相关性[J].现代肿瘤医学,2020,28(17):3063-3066.