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Fiber-knob嵌合型溶瘤腺病毒对胶质瘤细胞体外感染和杀伤活性分析

2025-01-20 19 上传者：管理员

摘要：针对恶性胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，患者的平均生存时间较短，传统治疗方法难以实现根治，而新兴的溶瘤病毒疗法存在扩散能力有限，治疗效果不理想等问题，通过基因工程技术对人5型腺病毒(Ad5)衣壳蛋白进行修饰，构建一种纤维蛋白头节区(knob)嵌合替换型溶瘤腺病毒，以提升其对胶质瘤细胞的感染和靶向能力.利用来自B亚群Ad37的knob替换Ad5的knob,证实其可利用唾液酸为受体，从而增强对胶质瘤等CAR(coxsackievirus and adenovirus receptor)低表达肿瘤细胞的感染和杀伤能力，并在体外模型中提升对血脑屏障的穿透效率，为恶性胶质瘤的治疗提供新的解决方案.

关键词：
发病率
基因工程
恶性胶质瘤
溶瘤腺病毒
颅内恶性肿瘤
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恶性胶质瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是发病率最高的颅内恶性肿瘤，目前患者的平均生存期通常不足15个月[1].由于其发生部位独特，生物学特征复杂，传统的治疗手段如手术、化疗和放疗难以对其实现根治.近年来，溶瘤病毒疗法作为一种新兴的恶性肿瘤治疗策略备受关注. 2022年，溶瘤单纯疱疹病毒在日本被批准上市用于治疗恶性胶质瘤[2-3],目前已有多个溶瘤病毒治疗恶性胶质瘤的方案进入临床研究阶段，所采用的溶瘤病毒包括腺病毒、单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒和脊髓灰质炎病毒等，其中以腺病毒的应用最广泛[4].

目前临床上使用溶瘤病毒治疗胶质瘤一般通过手术在颅内肿瘤处直接注射溶瘤病毒，虽然原位注射局部药物浓度高，但其扩散受限[5].对较大的肿瘤需多部位注射，增加操作次数；对易转移、容易多中心复发的恶性胶质瘤，病毒难以有效扩散至转移灶，因此治疗效果欠佳，这也是目前溶瘤病毒治疗胶质瘤普遍面临的问题[6].若实现溶瘤腺病毒静脉全身给药，需改变溶瘤腺病毒原本的感染性质，使其具有血脑屏障及恶性胶质瘤的双重靶向性.

溶瘤腺病毒多由人5型腺病毒(Ad5)经改造而成，称为条件复制型Ad5(CRAd5)[7]. Ad5感染细胞依赖于其纤维蛋白(fiber)和细胞表面柯萨奇-腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor, CAR)的结合，从而实现对细胞的感染[8].然而，CAR在胶质瘤细胞中的表达水平通常较低，正常组织细胞显著高于胶质瘤细胞的CAR表达量[9].这种特性导致溶瘤腺病毒在靶向感染胶质瘤细胞时效果不佳，严重限制了其在恶性胶质瘤治疗中的应用.因此，通过基因工程手段对溶瘤腺病毒衣壳进行遗传修饰，构建新的衣壳修饰型溶瘤腺病毒，使其具有更适合应用于恶性胶质瘤治疗的性质，提升溶瘤腺病毒对恶性胶质瘤的治疗效果.

由于不同亚群的腺病毒纤维蛋白序列和结构具有差异性，因此来自不同亚群甚至不同型别的腺病毒感染所依赖的受体不同[10].其中来自B亚群的Ad37可通过唾液酸作为受体感染细胞.唾液酸是神经发育过程中发挥重要生物学功能的分子，在脑内高丰度存在，而且唾液酸的表达量和肿瘤的恶性程度正相关，肿瘤恶性程度越高，唾液酸表达越多[11-12].基于此，本文通过使用Ad37的knob替换Ad5的knob,构建fiber-knob替换型溶瘤腺病毒载体，以使其具备用唾液酸作为感染受体的性质，实现增强对胶质瘤细胞的感染性，并在一定程度上提升溶瘤病毒静脉给药后对血脑屏障的靶向及穿透能力.

1、实验

1.1唾液酸表达水平分析

细胞生长至对数生长阶段，用胰酶消化后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，进行细胞计数，取1×106个细胞进行后续实验.加入生物素标记的唾液酸抗体，4℃孵育1 h后，用预冷的PBS洗涤2次，加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的链霉素，4℃孵育30 min,再用预冷的PBS洗涤2次，PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测.

1.2病毒感染性检测

用相同剂量感染细胞，在感染16 h后，用荧光显微镜观察红色荧光蛋白(RFP)的表达，并在相同拍摄条件(如曝光、曝光时间和激发光强等)下拍照.成像后，用不加乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化细胞，利用流式细胞术分析RFP的荧光强度.

1.3细胞活力检测

采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞活力.病毒以不同剂量感染细胞，37℃培养72 h后，加入MTT,避光孵育4 h,加入二甲基亚砜(DMSO)溶解蓝色颗粒，在490 nm处检测吸收值.细胞活力计算公式为细胞活力=实验组ΟD490-背景值对照组ΟD490-背景值×100%.

每种病毒每次感染剂量设置5个重复孔.

1.4穿透血脑屏障能力分析

将hCMEC/D3细胞在0.4 mm PTFE Transwell腔中培养6～7 d,用伏特/欧姆计测定细胞的跨膜电阻(TEER),分析细胞单层膜的完整性和功能.当TEER>50Ω/cm2时，在该模型中评估溶瘤腺病毒跨hCMEC/D3细胞层的转运能力.将病毒加入Transwell细胞层上侧培养基中，37℃孵育4 h后，检测细胞层下侧(基侧)培养基中的病毒量.

1.5体内靶向实验

用18～20 g雌性Balb/c裸鼠建立模型.小鼠先腹腔注射戊巴比妥钠麻醉剂(10 mg/mL生理盐水),剂量为每10 g体质量给药100μL.小鼠深度麻醉后，固定在脑立体镜上，用手术刀使头顶皮肤露出颅骨.根据小鼠脑图，将U87细胞(5×105个细胞，5μL)注射到所需部位(x=+2.5 mm,y=+0.5 mm,z=-3.5 mm).缝合小鼠的伤口，并注射青霉素以防止细菌感染.肿瘤接种7 d后，经尾静脉注射1×1011VPs(病毒颗粒数)溶瘤病毒. 5 d后，通过小鼠肿瘤组织内溶瘤病毒RFP的表达进行活体成像，分析溶瘤病毒的靶向作用.

1.6数据分析与统计

用Graphpad进行数据制图，使用SPSS软件进行统计分析.采用T-test检验对两组进行比较.在对两个或多个数据集的显著性进行分析时，采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验.当P<0.05时，其组间差异有统计学意义.

2、结果与讨论

2.1唾液酸在肿瘤细胞中表达水平分析

为评价唾液酸在不同类型和种属肿瘤细胞中的表达水平，先分析胶质瘤、肝癌和乳腺癌，再分别选择人肿瘤细胞和小鼠肿瘤细胞，对各表面的唾液酸表达水平进行检测，结果如图1所示.由图1可见，人肿瘤细胞均显著高于小鼠细胞中唾液酸的表达水平(***,P<0.001),为Ad5/K37溶瘤腺病毒的体内外评价提供了种属提示.

图1胶质瘤、肝癌和乳腺癌细胞唾液酸表达

2.2 Ad5/K37在不同肿瘤细胞中的感染性质分析

与Ad5相比，为探究Ad5/K37对不同肿瘤细胞的感染性质是否发生改变，分别评价10个不同的人肿瘤细胞系和5个小鼠肿瘤细胞系，分别利用Ad5和Ad5/K37在相同感染滴度下感染细胞，结果如图2所示.由图2可见，在10个不同人肿瘤细胞系中，除A2780细胞外，Ad5/K37均能显著提升对肿瘤细胞的感染性(*,P<0.05; **,P<0.01),尤其在胶质瘤细胞中，对细胞的感染率提升了12.42倍.在小鼠肿瘤细胞中，与Ad5相比，Ad5/K37能显著增加对细胞的感染能力，最高提升4.75倍(图2).表明通过knob37替换后得到的Ad5/K37在人肿瘤细胞和小鼠肿瘤细胞中均能显著增加溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的感染性.

2.3体外杀伤活性评价

选择6个不同人肿瘤细胞系，分别利用Ad5和Ad5/K37的不同滴度感染细胞，在感染72 h后检测细胞活力，结果如图3和表1所示.由图3可见，在不同肿瘤细胞中，Ad5/K37均具有显著的杀伤活性，如在胶质瘤U87细胞中，Ad5/K37显著高于Ad5的杀伤效果，通过计算EC50值(表1)可见，达到EC50的Ad5/K37显著低于Ad5的MOI值，Ad5组是Ad5/K37组EC50值的28.5倍，进一步证明Ad5/K37增强了对肿瘤细胞的杀伤能力.

图2 Ad5和Ad5/K37对不同肿瘤细胞系的感染性分析

图3 Ad5和Ad5/K37对不同肿瘤细胞系的细胞杀伤

2.4靶向能力评价

为确定Ad5/K37增强细胞感染性是否仅针对肿瘤细胞，是否更有可能具有靶向感染脑部细胞的性质，利用Ad5/K37在体外以相同的MOI感染人肾细胞(HEK293)、人微血管内皮细胞(hCMECD/3)和胶质瘤细胞(U87),结果如图4所示.由图4可见，Ad5/K37具有明显的脑细胞靶向性，可较好地感染hCMECD/3细胞和U87细胞.此外，用相同MOI的Ad5和Ad5/K37分别感染hCMECD/3细胞，发现Ad5/K37对hCMECD/3的感染性显著高于Ad5,提高了21.13倍，表明该修饰后的Ad5/K37能实现靶向感染脑部细胞的预期.

图4 Ad5和Ad5/K37对人脑部细胞的感染性质分析

表1 Ad5和Ad5/K37对不同肿瘤细胞系的细胞杀伤EC50值

为进一步验证该脑靶向效应是否可穿过血脑屏障，利用hCMEC/D3细胞在体外建立血脑屏障模型.当hCMEC/D3细胞生长到TEER>50Ω/cm2时，将病毒加入细胞培养基的上层孵育4 h.收集下层培养基，对下层穿透细胞屏障的病毒进行定量分析，结果如图5所示.由图5可见，病毒孵育4 h后，血脑屏障细胞的电阻无明显变化，说明病毒并未破坏血脑屏障.与Ad5相比，Ad5/K37在下层可检测到更多病毒数，说明Ad5/K37能增强其穿透血脑屏障的能力.

图5 Ad5和Ad5/K37体外穿透血脑屏障能力

为评价Ad5/K37在体内对胶质瘤的靶向能力，利用U87细胞系建立BALB/c裸鼠颅内荷瘤模型，通过静脉注射溶瘤腺病毒进行治疗，5 d后，通过检测病毒载量和病毒的RFP表达分析Ad5/K37穿透血脑屏障的能力和肿瘤靶向能力，结果如图6所示.由图6可见，Ad5/K37在颅内荷瘤小鼠模型中未提高穿透血脑屏障的能力，由于Ad5/K37在小鼠各组织器官中的分布均少于Ad5,因此，在体内Ad5/K37可降低溶瘤腺病毒对正常组织器官的感染，但未显著提高血脑屏障穿透能力.

图6 Ad5和Ad5/K37在小鼠体内脑原位胶质瘤中的靶向性分析

综上所述，通过对人5型溶瘤腺病毒knob区域进行嵌合替换，改变溶瘤腺病毒的感染性，显著提升了溶瘤腺病毒对多种CAR低表达肿瘤细胞的感染能力，显著增强了对肿瘤细胞的杀伤活性，并增强了对脑部细胞的感染性.在体外血脑屏障模型中，Ad5/K37病毒可有效穿过血脑屏障.在体内脑原位胶质瘤的靶向实验中并未发现Ad5/K37能有效穿过血脑屏障而到达肿瘤部位，这可能与种属差异有关，由于在小鼠模型中人腺病毒不能较好地实现脑组织靶向性，因此将利用其他动物模型进一步分析评价Ad5/K37在体内的靶向性.此外，通过体内靶向实验发现，Ad5/K37可减少病毒在体内其他脏器中的病毒富集量，从而减少病毒的组织毒性，有利于Ad5/K37在体内肿瘤治疗的应用.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(批准号:32071466);

文章来源:刘文茉,王立正,于彬,等.Fiber-knob嵌合型溶瘤腺病毒对胶质瘤细胞的体外感染和杀伤活性分析[J].吉林大学学报(理学版),2025,63(01):201-206.