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循环肿瘤细胞中捕获微纳技术的研究

2020-07-08 229 上传者：管理员

摘要：循环肿瘤细胞被认为是肿瘤转移的一个重要因素，其精确检测对监控患者病情、治疗效果以及预测预后具有重要的临床指导意义。然而，由于在外周血中的循环肿瘤细胞个数极少，对它的检测要求使用高特异性、高灵敏度的快速检测技术。近些年纳米技术的发展为循环肿瘤细胞的检测提供了新的机遇。文章综述了近年来循环肿瘤细胞分离与检测技术的研究进展，重点介绍了纳米材料、微流控技术在循环肿瘤细胞捕获中发挥的重要性。

关键词：
循环肿瘤细胞
微流控
特异性捕获
纳米材料
肿瘤实验研究
肿瘤转移
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2012年，根据世界卫生组织(WHO)的报告，每年约有820万人死于癌症。随着人口数量和寿命的增加，预计到2025年，新发癌症病例将达到2000万左右。这表明癌症已经严重威胁到人类的生命和健康[1]。随着对癌症研究的深入，科学家们发现，癌症无法治愈的主要原因是肿瘤细胞的浸润和侵袭引起的肿瘤转移[2]。90%的癌症患者最终死于肿瘤转移，因此早期发现、监测和治疗肿瘤转移具有重要意义[3]。

1、循环肿瘤细胞(CTCs)

循环肿瘤细胞(CTCs)被认为是肿瘤转移的一个重要因素，对它的检测在一个世纪前就被奥地利药学家T.R.Ashworth[4]所描述。血液中循环肿瘤细胞的存在非常符合关于肿瘤转移的“种子与土壤”的理论：从原发肿瘤分离后，肿瘤细胞可以进入血液循环系统，并且迁移到远处的器官，在那里进行植入并且引起肿瘤转移[5,6,7,8]。

虽然通常状况下，人们认为肿瘤细胞的转移扩散意味着死亡，但是转移也有可能发生在疾病的早期阶段。据调查，有30%～40%具有固体瘤的病人会存在隐匿性的肿瘤细胞转移，这种现象与疾病的进展有着重要的关系。外周血中或骨髓中的循环肿瘤细胞分离与已被报道的各种癌症相关，如乳腺癌[9]、结肠癌[10]、前列腺癌[1]、肾癌[12]、膀胱癌[13]和非小细胞性肺癌[14]等。因此，循环肿瘤细胞的检测和分析在癌症病人的诊断和治疗中显得至关重要，而且最近的医学研究表明，循环肿瘤细胞可以提供一些非常有价值的临床信息，如复发的早期诊断、辅助性治疗有效性的检测[15,16]，并且可以作为一个独立的预后因素[17]。以循环肿瘤细胞所提供的临床信息为例，Cristofanilli等[18]对177个乳腺癌病人进行了研究，将外周血中的循环肿瘤细胞数量作为病人的生存指标，结果显示，7.5mL血液中有大于5个循环肿瘤细胞的病人只能生存2.7个月，而小于5个循环肿瘤细胞的病人可以生存7个月。

在过去10年里，循环肿瘤细胞的计数一直被应用于肿瘤分期的辅助手段[19]、疗效监控[20]、复发预测[21]、预后评估[22,23]等临床应用。然而，由于循环肿瘤细胞在大批血液细胞中的低丰度(每109个血细胞中仅有几个到几百个循环肿瘤细胞[24])，其分离面临技术上的挑战。目前各种CTCs的检测体系主要包括CTCs分离和富集系统以及CTCs检测和鉴定系统。现在临床上使用较多的分离富集法有免疫磁珠分离法和基于形态学的富集法(密度梯度离心分离法和膜滤过分离法)[25]。检测方法有免疫细胞化学技术、流式细胞术、聚合酶链反应和逆转录聚合酶链反应及其各种改进的技术等。然而，这些检测技术普遍存在以下缺点：需要前期分离富集步骤、灵敏度和特异性低、花费高[26]。

2、循环肿瘤细胞(CTCs)微纳捕获技术

纳米材料具有独特的纳米效应(如大比表面积、高反应活性、快速电子传输能力和特殊光电性能等)，可以显著增强传感信号的灵敏度，因此可用于发展高灵敏新型检测原理及技术。纳米材料优异的可复合性、可修饰性、可组装性使得传感材料的功能化及传感器件制备的多样化更加简便易行，是发展可在复杂干扰体液背景条件下实现高选择性的快速、准确测定低丰度CTCs的有效方法和途径。近年来，微流控芯片、纳米材料(如金纳米颗粒、磁性纳米颗粒、碳纳米管和纳米线等)已经被广泛应用于CTCs的富集、分离。根据分离原理，这些方法主要可分为基于物理性质分离及基于亲和识别分离两类[27]。其中：基于物理性质分离主要利用癌细胞与正常血细胞在尺寸[28,29]、密度[30,31]、变形性[32]及黏附性[33]等方面的差异对癌细胞进行分离[34]，密度梯度离心法、滤膜过滤方法、水动力分离法和介电泳(DEP)细胞分离法等技术已经被发展用于从血液中提取CTCs[35,36,37,38]；而基于亲和识别分离则是采用抗体[39,40]、核酸适配体[41,42]或E选择素[43,44]等物质识别癌细胞表面特定抗原，从而实现CTCs特异性识别及分离。

2.1基于物理性质的CTCs分离

一般情况下，癌细胞在尺寸上大于血液中白细胞、红细胞及血小板等其他成分，因此可根据细胞的大小不同，采用过滤方式分选CTCs。

Hosokawa等人[28]设计了具有尺寸选择性(8～9μm)的微腔阵列微流体装置(图1)，用于全血中癌细胞的快速分离。对于添加10～100个肺癌NCI-H358细胞的1mL血液样品，该装置的分离效率可达97%，且回收细胞的活力约为98%。

图1具有尺寸选择性的微腔阵列微流体装置对癌细胞进行筛选[28]:

2.2磁分离技术

目前唯一通过美国FDA认证的CTCs检测技术CellSearch系统，就是利用免疫磁珠富集技术实现对转移性乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌CTCs的半自动化检测，具有较高的准确性和可重复性[45]。磁性纳米颗粒表面经修饰改性后，可偶联抗体、酶、DNA或RNA等多种生物活性物质[46,47]，通过这些生物分子与细胞表面的特异性受体结合，实现细胞的分离与检测[48]。此外，修饰了生物活性分子的磁性纳米颗粒还可与其他纳米颗粒如量子点、金纳米颗粒等结合，构成多功能纳米探针，更加快速方便地用于生物体系中特定组分的捕获和分离[49,50]。

2.3基于微纳米基质的CTCs分离

研究发现细胞表面存在着许多微纳米结构，如微绒毛、丝状伪足、片状伪足等，这些微纳米结构形貌会对细胞的黏附、运动等行为产生影响[51]。由于纳米结构基底与细胞表面结构的相似性，CTCs更倾向于吸附在纳米结构表面。纳米基质因包含纳米尺度级别的拓扑结构，已经被广泛用于组织工程学及再生医学等领域[52]。研究者们一直期望能够通过优化材料表面的纳米结构形貌，调节材料表面化学性质，如化学组成、亲/疏水性等来调控细胞在材料表面的黏附、迁移甚至动态的释放过程[53,54,55]。

纳米结构可促进细胞与基质的相互作用，有利于细胞黏附、迁移、增殖、分化及天然细胞外基质形成[56]，这一特征对少量细胞的分离分析非常有利。尽管与基于物理性质的分离方法相比，基于亲和反应的CTCs检测方法可获得更高的捕获效率及特异性，但仍较难实现高纯度、高活力的CTCs分离。若将亲和识别分离与仿生纳米基质结合，不但能提高抗体在基质表面的负载量[57]，同时可减缓细胞在通道中的运行速度，增大与基质界面的碰撞几率，因而可进一步改善CTCs的分离效果。研究表明，纳米结构可与细胞表面的微观结构发生相互作用，在无捕获试剂的情况下也可实现对癌细胞的捕获及分离[58]。因此微纳米基质为探索制备高效CTCs分离器件提供了新思路。

Wang等人[59]通过湿法刻蚀在硅片表面制备硅纳米柱阵列(图2)，并在纳米柱表面固定antiEpCAM抗体，用于乳腺癌细胞MCF-7的分离。实验结果表明，硅纳米柱基质对细胞的捕获效率几乎为硅平面基质的10倍，并且该装置对MCF-7细胞的捕获效率随着硅纳米柱的长度增加而提高。

图2硅纳米阵列捕获乳腺癌细胞[59]:

Lee等人[60]构建了以石英纳米线阵列为基质的CTCs分离装置并用于肺癌细胞A549的高效分离(图3)。这些结果表明三维拓扑作用在细胞分离中扮演着十分重要的角色。

Zhang等人[61]以钛酸四丁酯和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为前体，在硅片表面通过静电纺丝制备PVP及TiO2的复合纳米纤维，通过煅烧除去聚合物模板，最终形成直径为100～300nm的TiO2纳米纤维(图4)。TiO2纳米纤维进行硅烷化及抗体修饰后，用于癌症病人血样中CTCs的捕获。

图3石英纳米线阵列捕获肿瘤细胞[60]:

Sekine等人[57]构建的基于导电聚合物聚乙烯二氧噻吩(PEDOT)的纳米粗糙表面可提高细胞分离效率。他们通过电聚合方法在氧化铟锡(ITO)表面形成纳米尺寸范围的PEDOT-COOH纳米点，修饰EpCAM抗体后用于癌细胞分离。实验结果表明，由于配体-受体、基质纳米结构-细胞微观结构的协同相互作用，具有纳米点的粗糙界面对癌细胞的捕获效率为无纳米点基质的4～5倍。

Wu等人[62]以氧化石墨烯为基础，构建了以癌细胞为对象的电化学检测装置。他们在经过预处理的玻碳电极表面沉积氧化石墨烯并进行电化学还原，连接抗体后与细胞孵育；在此基础上，将修饰有量子点的二氧化硅纳米颗粒耦联抗体，并与固定于电极上的细胞形成免疫夹心结构，通过方波伏安法及荧光成像实现了癌细胞的定量测定。

Liu等人[63]利用层层自组装方法在ITO电极表面修饰了碳纳米管薄膜，修饰EpCAM抗体后应用电化学阻抗谱及循环伏安法对人类全血中的肝癌细胞进行了检测。该传感器检测灵敏度高，特异性强，检测下限可达到5mL-1，线性范围为10～105mL-1，而对正常细胞(如血细胞)则不会产生响应。在此基础上，他们利用纳米压印技术加工了表面三维微纳米阵列结构，在修饰苯硼酸基团后实现了MCF-7肿瘤细胞的特异性捕获与释放，其对MCF-7细胞的检测范围为5～105mL-1，检测下限为5mL-1[64]。

图4TiO2纳米纤维捕获癌症细胞[61]:

Huang等人[65]以胞吞磁性纳米粒子后的巨噬细胞为模板，在细胞表面进行硅化处理并高温煅烧，在硅材料表面保持了细胞形貌。他们通过在其表面修饰抗体，可获得具有拓扑结构、磁性、生物靶向多功能的微米探针并用于癌细胞分离。

2.4基于微流控芯片的CTCs分离

近年来，微流控芯片装置因其尺寸小、比表面高、流体可控及高度集成化等特点，已逐渐成为生物医学分析的重要平台，并广泛用于细胞培养、分选及检测等过程。基于微流控芯片的CTCs分离方法通过在芯片通道内部修饰可识别细胞表面抗原的抗体或核酸适配体，当通入含CTCs的样本时，CTCs与通道表面捕获试剂结合，实现特异性分离。该法所需样品量小，无需对血液样品进行前处理，且流动的流体环境有利于去除非特异性吸附的其他细胞，从而提高分离纯度。

Nagrath等人[24]通过刻蚀法在硅片表面制备了78000个呈等边三角形排列的圆形微柱，并在微柱表面修饰anti-EpCAM抗体，将其用于病人血样中CTCs分离。当流速为1～2mL/h时，该装置能从116个癌症病人血样中检测出115个含CTCs的样本，分离纯度为50%，表明了该装置的灵敏性、特异性及有效性。

Kim等人[66]将硅片与玻璃基底键合，并对硅片进行化学机械抛光及反应离子刻蚀等操作形成微腔阵列，在硅片顶部再次键合玻璃形成CTCs过滤装置(图5)。然后他们采用修饰抗体的微珠捕获靶细胞并放大细胞尺寸，便于血样流经芯片时拦截被捕获的细胞，而白细胞及红细胞由于尺寸较小随流体流动而被除去。该法回收率可达89.7%。由于芯片顶部及底部的玻璃具有良好透光性，分离后的细胞可进一步成像观察。

图5微流控芯片捕获靶细胞[66]:

(a)利用修饰有anti-EpCAM的固体微球结合CTC，以增大CTC的尺寸，可以实现与体积相似的白细胞进行区分；(b)多障碍尺寸过滤结构芯片，每个结构单元有两个过滤间隙，第一个间隙和第二个间隙之间的“细胞捕获室”可以有效降低非目标细胞的干扰

Stott等人[67]设计了含鱼骨结构的8通道PDMS芯片，并将之与玻璃基底键合，在通道内部修饰抗体形成细胞分离装置。如图6所示，将含靶细胞的血液样品通入芯片时，鱼骨结构大大增加细胞与基质表面的碰撞几率，进一步提高了捕获效率。借助免疫荧光染色方法及成像设备可对捕获到的细胞进行定性及定量分析。对于血样中掺杂的前列腺癌细胞，该装置可以实现91.8%的捕获效率，纯度为14%。

3、尚存的问题与发展趋势

总体说来，基于物理性质的CTCs分离方法较为简单，能较大程度保持细胞的完整性及活性，且对不同种类的CTCs均可分离，但此类方法缺乏特异性，易遗失相应尺寸及密度以外的肿瘤细胞。相比之下，基于免疫识别分离的方法可针对性分离表达特定抗原的细胞，具有更高的特异性。由于CTCs膜表面特异表达角蛋白(CK)、上皮细胞黏附分子EpCAM以及组织有关标志物如表皮生长因子受体(EGFR)、前列腺抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)等物质，若将识别上述抗原的抗体或核酸适配体固定在固相基质上，则可实现CTCs特异性分离。免疫识别分离方法中，磁性纳米颗粒良好的磁导向性为CTCs的可控分离提供了便利，而微纳米基质具有高比表面积和特殊形貌，可增加基质表面的抗体负载量，并通过三维拓扑相互作用增加细胞在基底上的黏附力，提高捕获效率。微流控芯片技术将采样、预处理、反应、分离、检测等功能集成在微芯片上，不但可以省去样品的前处理步骤，还可通过流体冲洗提高分离纯度。在此基础上将多种策略结合用于CTCs检测[68,69]，不但可以保留各自优势，还能发挥不同基质间的协同作用，进一步提高捕获效率及纯度。

血液中CTCs因含量稀少且存在异质性[70,71,72]，给它的分离分析带来了巨大挑战。尽管以纳米技术、微流控芯片、控制释放为基础的CTCs分离纯化体系已取得了重要进展，但要发展成能真正用于癌症病人血液样本检测的方法，实现CTCs的快速灵敏捕获、高效无损释放以及后续基因分析，当前依然面临严峻挑战。首先，CTCs的分离纯度仍有待提高。研究表明，使用磁性纳米颗粒、微纳米基质或含特定结构设计的微流控芯片可获得理想的分离效率，但CTCs目前的分离纯度普遍较低。因此，通过发明新材料或发展新方法，保证CTCs高效捕获的同时，采取有效手段提高CTCs的分离纯度是当前的一个重要研究方向。其次，CTCs的无损释放及后续基因分析也是一个重要研究课题。当前，已有部分CTCs可逆释放体系取得了可喜进展，但释放过程中存在细胞损伤及释放效率较低等问题。因此，必须建立温和的CTCs释放体系，获取纯度高、活力好的CTCs，方便对其进行后续培养及再分析。此外，CTCs的研究应进一步深入，将释放后的CTCs体外培养，用于研究肿瘤转移机制并与体外药敏实验相结合，将有助于建立基于CTCs的肿瘤个性化治疗技术。

图6含鱼骨结构的8通道微流控芯片[67]:

(a)微流控芯片由具有单入口和单出口的微流控通道阵列组成；(b)微流控通道阵列放大照片，显示了人字形沟槽的不对称性和周期性；(c)和(d)人字形沟槽微流控通道阵列与平滑微流控通道对于细胞流动和捕获的对比示意图；(e)和(f)人字形沟槽可以产生流体力学的混沌现象，而平滑的微流控通道则缺少混沌

参考文献：

[25]王振丹,赵文华,李胜.循环肿瘤细胞检测方法研究现状[J].中华肿瘤防治杂志,2014,21(17):1391-1394.

刘洋,刘绍琴.循环肿瘤细胞捕获微纳技术[J].自然杂志,2020,42(03):201-209.