肿瘤是指机体在各种物理、化学或生物性因素作用下,发生损伤,局部组织细胞异常增生所形成的新生物。随着社会的不断发展,肿瘤逐渐成为威胁人类健康的重大因素,且发病人群越来越年轻化。目前临床上肿瘤的治疗多采取手术切除、放疗、化疗等方法,特异性差、对病人的损伤大,且易复发。因此,有学者提出精准医疗这一概念[6,7]。几十年来,科学家一直在努力开发用于研究人体原发性肿瘤和正常细胞增殖的方法[2,4]。迄今为止,传统细胞系仍然是细胞生物学和人体肿瘤研究的主要材料。然而,肿瘤细胞系的构建成功率低(1%～10%),取决于组织疾病的起源和进展情况且原发性肿瘤存在复杂的异质性,这些异质性无法在细胞系中体现,极大地限制了基础医学和转化医学的发展[3]。条件性重编程(CR)细胞培养技术是指在Rho激酶抑制剂(Y-27632)存在的培养体系中,将经过辐射处理的3T3-J2细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)与获取的人原代细胞共培养,使人原代细胞获得部分干细胞特性和在体外无限制扩增的能力,并保留原有肿瘤的遗传学和生物学特性[18]。CR技术在没有任何外源性基因导入的情况下,即可在短时间内获取大量的人原代细胞,使得在体外长期稳定地扩增人原代肿瘤细胞成为了一种可能[1,5]。本文旨在利用CR技术建立体外稳定扩增人乳腺癌细胞和肺癌细胞的体系,为后续转化医学的研究和精准医疗打下基础。

1、材料与方法

1.1标本来源

收集来自温州医科大学第一附属医院心胸外科、甲乳外科的肿瘤组织标本,所有组织标本取材均告知患者及其家属,并经过患者本人及其家属的同意,且经温州医科大学伦理审查委员会审查批准所有组织在处理以及保存前均经病理专家确认为恶性肿瘤。

1.2试剂及仪器

3T3-J2细胞购自美国Kerafast公司;DMEM培养基、谷氨酰混合物、胎牛血清、高糖DMEM培养基、F-12培养基、青霉素/链霉素双抗、谷氨酰胺、0.05%EDTA-胰酶、0.25%EDTA-胰酶购自Life Technologies公司;霍乱毒素、秋水仙素、细胞消化液购自Sigma公司;胶原酶、透明质酸酶、氢化可的松、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、Triton-X100、4%多聚甲醛、中性树胶购自索莱宝公司;庆大霉素、两性霉素B购自生工生物工程(上海)股份有限公司;小牛血清BCS购自Hyclone公司;Y-27632购自Enzo公司;HE染色剂购自碧云天生物技术公司;抗体CD44、p63、二抗、DAB显色液购自DAKO公司;PE-AntiHumanCD44购自Biolegend公司;FITC-AntiHuman EpCAM购自Abcam公司;基质胶购自美国Corning公司。

6孔和24孔细胞培养板以及6孔超低吸附培养板购自美国Costar公司;CO2细胞培养箱购自美国Forma Scientific公司;倒置显微镜购自Nikon公司。

1.3人原代细胞的分离纯化

将外科手术中切除的肿瘤组织放入含有1%双抗的DMEM培养基中,立即用冰盒运输至实验室。去除组织中多余坏死组织以及脂肪组织后立即用PBS清洗多次,然后在含有0.1%的胶原酶IV、10%胎牛血清的DMEM培养基中剪成1mm[3]的碎片。37°C培养箱中消化2h,用胶头滴管吸取培养基至无菌离心管中200×g离心4min,去除上清后,加入培养基重悬下层沉淀。

1.4人原代细胞的传代培养

获取的原代细胞与饲养细胞在条件性培养基中按照细胞数为4׃1的比例进行共培养。饲养层细胞为经过30戈瑞X射线辐射处理的3T3-J2鼠成纤维细胞;条件性培养基为DMEM/F12(V/V,3׃1)培养基,并添加10%胎牛血清,多种生长促进因子包括0.125μg/mLEGF、5μg/mL胰岛素、25μg/mL氢化可的松、8.6ng/mL霍乱毒素以及10μmol/mLY-27632。细胞放入37°C、5%CO2培养箱培养,每2～3天更换1次饲养层细胞。更换饲养层细胞时先用PBS润洗细胞,之后加0.05%胰酶于37°C培养箱中消化1～2min,饲养细胞对胰酶较为敏感,此时轻拍6孔板底部,饲养细胞即从培养板脱落,从而实现分离。肿瘤细胞传代时需先按照上述操作去除饲养细胞,之后用细胞消化液消化3～8min,吸取细胞消化液于离心管中,300×g离心5min后,加入条件性培养基传代培养。

1.5人原代细胞的染色体标本制备

取处于对数生长期的人原代细胞,向其中加入秋水仙素至终浓度为0.2μg/mL,继续培养3h,之后终止培养。500×g离心6min,去除上清液后使用适量0.075mol/L的KCl重悬细胞沉淀,37°C水浴20min后,向悬液中加入1mL固定液,轻轻混匀后,500×g离心6min去除上清液。向沉淀中加入8mL固定液,混匀后室温下静置固定20min,500×g离心6min。之后重复固定1次,500×g离心6min,依据细胞沉淀的量,加入适量的固定液,混匀后制备成磨砂状悬液。吸取2滴悬液滴加在干净的载玻片上,轻轻吹散悬液后于火焰上烤干。70°C烘烤2h使标本老化。将老化处理的标本放于37°C水浴预热的0.025%胰蛋白酶液中消化2min,用生理盐水漂洗标本,终止消化,之后用Gimsa染液染色15min,流水缓慢冲洗标本,最后将标本放于室温下晾干,显微镜下观察染色体形态。

1.6短串联重复序列(STR)分析

取适量的细胞或组织,向其中加入适当的细胞裂解液(200mmol/LTris-HCl、5mmol/LEDTA、400mmol/LNaCl、0.1mg/mL蛋白酶K),并于60°C水浴过夜。吸取少量裂解液,加入9倍体积的超纯水进行稀释。最后取少量稀释液体作为模板,根据Amp FISTRI dentifier Plus(AB)试剂盒进行操作,依照指定程序进行PCR扩增反应,最后Gene Mapper ID-X软件分析基因型。

1.7HE染色

取对数生长期的人原代细胞,以5×10[5]个/孔的细胞数接种于6孔板的玻片上,培养2～3天后取出细胞爬片,4%多聚甲醛固定20min后用PBS漂洗细胞3次,每次5min;常温下用苏木素染色5～8min后,流水冲洗10min;伊红染色1～2min后,流水洗涤细胞爬片;室温风干后,用中性树胶封片,显微镜下镜检。

1.8免疫组化

固定前处理同HE染色。固定后细胞爬片用0.5%Triton-X100溶液室温下对细胞进行通透处理,处理后用PBS洗涤3次,每次5min。滴加3%H2O2于细胞爬片上,室温下作用15min后,PBS洗涤爬片3次。2%BSA室温封闭30min,PBS洗涤3次,之后滴加稀释好的一抗,放入湿盒中,4°C孵育过夜。PBS洗涤3次,之后加入稀释好的二抗,室温下孵育,PBS洗涤3次。之后加入二抗,于湿盒中室温下孵育2h。PBS洗涤细胞,滴加DAB溶液室温下显色8～10min。用蒸馏水冲洗爬片,之后用苏木素染色3～5min。再将玻片用流水冲洗。接下来依次从75%浓度到85%浓度再到95%浓度最后到100%浓度的酒精中梯度脱水（各个浓度的酒精脱水2min）。二甲苯之中透化,待玻片干燥后,用中性树胶封片,显微镜下镜检。

1.9人原代细胞的悬浮培养

取生长状态良好的人原代细胞,利用0.05%胰酶-EDTA去除饲养细胞后,再利用Accutase细胞消化液将原代细胞消化为单细胞悬液。向培养皿中加入原代细胞培养基终止消化,将细胞悬液收集于15mL离心管之中,300×g离心5min。吸弃上清,加入1mL条件性培养基重悬细胞沉淀,镜下计数。将细胞悬液的密度调整为1×10[5]/mL,之后将细胞悬液加入6孔低吸附培养板之中,每孔2mL。晃动6孔板,使孔中的细胞分布均匀,再将细胞放入培养箱之中培养。之后每天显微镜下观察细胞生长情况。

1.10细胞球接种

将基质胶与条件性培养基按照5׃1的比例混匀,迅速将其放在冰上。收集悬浮培养的细胞球悬液于离心管之中,4°C500×g离心5min。去除上清,将细胞沉淀与基质胶混匀。迅速将基质胶转移至6孔低吸附培养板中央。37°C培养箱中孵育30min。向孔中加入2mL条件性培养基。放入培养箱中继续培养。2天后,显微镜下观察细胞球生长情况,并拍照记录。

1.11流式细胞术检测人细胞CD44、EpCAM表达情况

取培养的原代细胞,将细胞处理为单细胞悬液,300×g离心5min。去除上清,用PBS溶液重悬细胞,之后将细胞悬液转移至96孔尖底板中,2500r/min离心3min,弃去上清。按照1׃200的滴度,在冰上利用PBS稀释PE-CD44、FITC-EpCAM抗体,配制成染色液。向每孔中加入50μL细胞染色液重悬细胞沉淀。4°C避光孵育20min。2500r/min离心3min,弃去上清。向孔中加入PBS溶液重悬细胞。离心后重复该步骤1次。利用200μLPBS重悬细胞,将悬液转移至流式管中,流式细胞术检测细胞表面分子表达情况。

2、结果

2.1利用条件性重编程技术可扩增原代肺癌细胞以及原代乳腺癌细胞

患者基本信息见表1,在获取肿瘤细胞后,利用条件性重编程细胞培养技术对原代肿瘤细胞进行培养,显微镜下可见类似“鱼眼状”上皮细胞(图1A和图1B:人乳腺癌细胞;图1C和图1D:人肺癌细胞),并可在较长时间内持续传代(图2)。

表1患者基本信息

图1原代肺癌细胞及原代乳腺癌细胞生长情况

图2原代肿瘤细胞的细胞倍增代数曲线

2.2利用条件性重编程技术培养的肿瘤组织源性原代细胞染色体为多倍体

肿瘤细胞的染色体多存在缺失、倒位或多倍体等异常现象,为确认利用条件性重编程技术培养的肿瘤组织源性的原代细胞中是否存在肿瘤细胞,我们制备了原代细胞的染色体标本,并对其进行了G显带处理(图3)。从图3中可以看出,利用条件性重编程技术培养的肿瘤组织源性的原代细胞的染色体中,存在多倍体。

2.3原代肿瘤细胞及其来源组织的STR结果对比分析

为确认利用条件性重编程技术扩增的原代细胞是否保留了其来源肿瘤组织的分子遗传学特性,我们选取了一株目前传代时间最久的原代细胞,对该细胞以及其来源组织进行了STR鉴定分析,分析结果显示,原代细胞保留了其来源组织的大部分分子遗传学特性(表2和表3)。

2.4原代细胞的HE染色及免疫组化鉴定

为了进一步确定利用条件性重编程技术扩增的肿瘤组织源性原代细胞中是否存在肿瘤细胞,我们将原代细胞制成细胞爬片,并对细胞爬片进行了HE染色鉴定以及免疫组化鉴定。在HE染色片中可见明显的细胞核分裂相以及多核瘤巨细胞,经病理学专家镜检证实扩增的细胞中存在肿瘤细胞(图4)。同时,免疫组化结果显示,利用条件性重编程技术培养的原代细胞表达CD44、P63(图5),CK7、ER、PR以及HER-2等常见细胞表面标志物(数据未展示)。

2.5条件性重编程技术培养的原代细胞具有干细胞特性

前已述及,细胞免疫组化结果显示,利用条件性重编程技术培养的原代肿瘤细胞强表达常见的干细胞标志物CD44。为进一步探究培养的原代细胞是否存在干细胞特性,我们将培养的原代细胞处理为单细胞悬液后,在超低吸附培养板中继续培养细胞,观察细胞能否自发形成干细胞样细胞球,结果显示,在悬浮培养的条件下原代细胞可自发形成细胞球。将细胞球接种于基质胶中,对细胞球进行类器官样培养,结果显示,细胞球可继续增长并相互融合(图6)。之后,我们利用流式细胞术检测原代细胞表面表达常见的干细胞表面标志物CD44以及常见的上皮细胞标志物EpCAM的表达情况,结果显示,原代细胞强表达CD44,不表达EpCAM(图7)。

图3不同细胞中的染色体分布情况

表2利用条件性重编程技术培养的原代细胞STR的鉴定结果

表3原代细胞的来源组织的STR鉴定结果

图4利用条件性重编程技术培养的原代细胞的染色片

图5利用条件性重编程技术培养的原代细胞的免疫组化鉴定结果

3、讨论

恶性肿瘤危害人类健康,降低生活质量。数据显示,2018年全球新增约1800万恶性肿瘤患者,960万恶性肿瘤患者死亡,其中肺癌和乳腺癌患者的新发病例数以及死亡数高居榜首[8]。而在我国,肺癌患者人数为78.7万,乳腺癌患者人数为30.4万,分别位列恶性肿瘤病例人数第一、第五[9]。由于个体间差异以及肿瘤细胞的异质性,不同的恶性肿瘤患者对不同化疗药物的反应存在较大差异,部分患者在接受常规的化疗之后很快出现了肿瘤的复发和转移[10]。另外,部分恶性肿瘤患者携带罕见突变,运用常规的化疗手段进行治疗往往收效甚微。选择合适的化疗方案,不仅可以增加患者的生活质量,延长患者生存期,同时也可以减少医疗资源的过度使用以及浪费。因此,建立临床相关的个体化肿瘤模型,筛选最佳的化疗药物组合,发现肿瘤发生发展以及耐药的新机制,具有广泛的应用前景以及临床价值[11]。

传统的原代细胞培养方法耗时长,且成功率较低,不适于建立个体化肿瘤模型。目前使用较多的个体化细胞培养模型包括:过表达hTERT[12,13,14]、cmyc[15]等基因,诱导多功能干细胞(iPSCs)、3D细胞培养[16]、异体移植模型(PDX)[17]等。然而,这些方法操作复杂、耗时较长,且价格昂贵,不利于个体化肿瘤模型的大规模建立推广。近年新开发的条件性重编程原代细胞技术具有在体外无需基因修饰,可在短时间内获取大量的原代细胞,价格相对较低等优势。目前,利用该方法建立的个体化肿瘤模型,并进行相应研究的例子已有很多:研究者利用条件性重编程细胞技术,体外扩增了一名具有20年复发性呼吸道乳头状瘤病史的患者的肿瘤细胞,通过药敏实验以及基因分析选择了针对该患者的最佳化疗方案,并成功治愈了该患者[18];Beglyarova等[19]利用条件性重编程技术,培养出了原代胰腺癌细胞,并发现MYC-ERCC3相互作用在胰腺癌的发生发展过程中的起重要作用,可作为临床上治疗胰腺癌的潜在靶标;Timofeeva等[20]利用条件性重编程技术扩增了前列腺肿瘤细胞,并确定它可作为研究人前列腺的个体化模型。以上研究充分展示了条件性重编程技术在个体化治疗领域的潜力。因此本文采用条件性重编程原代细胞培养方法,体外培养肿瘤细胞。

体外培养的肿瘤细胞,由于外界理化因素的作用,其各项生物学特性可能会发生改变,无法准确地反映出体内细胞的特点。故在本实验中,我们对利用条件性重编程技术培养的原代细胞的不同生物学特性进行了研究。在本研究中,我们利用条件性重编程技术,成功扩增出了原代乳腺癌细胞以及原代肺癌细胞,并通过STR分析技术明确了利用条件性重编程技术扩增的原代细胞保留了其来源组织的遗传特性。同时通过染色体分析、HE染色确定了利用条件性重编程技术培养的原代细胞中含有肿瘤细胞。另外,为进一步对扩增的细胞进行鉴定,我们对扩增的原代细胞进行了免疫组化染色鉴定。有趣的是,除了CD44以及P63以外,原代细胞并不表达常见的肺癌、乳腺癌细胞表面标志物(ER、PR、CK7等)。查询资料得知,乳腺癌细胞在体外培养的条件下,细胞表面的ER、PR表达会下调[21],这与我们的细胞免疫组化结果相符。另外有报道称,在原代肺癌细胞中,CD44、CD90阳性的细胞,表现出间充质干细胞的特征[22],并可在干细胞培养体系中形成细胞球。另外有研究者发现,原代肺癌细胞中,部分细胞表现出间充质细胞的特征:不表达CK7、EpCAM等常见上皮细胞标志物[23]。由此我们推测,利用条件性重编程技术扩增的细胞,具有间充质干细胞的特征。我们通过悬浮培养、流式细胞术,确定了利用条件性重编程技术培养的原代细胞表达CD44,可悬浮培养,但不表达EpCAM。结合免疫组化结果,我们推测,利用条件性重编程技术培养的原代细胞,是具有部分间充质干细胞特性的原代肿瘤细胞。总之,我们验证了利用条件性重编程细胞培养技术,可以在较短时间内扩增出大量的原代肿瘤细胞,所扩增的原代细胞保留了大部分源组织的分子遗传学特性,可以用于建立个体化肿瘤模型,同时原代细胞具有了部分干细胞特性。

图6原代细胞的悬浮培养以及类器官培养

图7原代细胞CD44、EpCAM的表达情况

参考文献：

[7]王红阳.精准医疗时代的肿瘤生物标志物发展.山东大学学报(医学版)

[10]黎张燕,唐欲博,罗红鹤,程超,柯尊富,陈孝.人原代肺癌细胞体外长期培养及个体化药敏研究.今日药学.

[11]梁亚冰,张满,杜华,杨凌.食管鳞状细胞癌组织体外3D培养.中国细胞生物学学报.

赵鸿雁,赵旋,陈如章,高基民.条件性重编程人源肿瘤细胞初步研究[J].中国细胞生物学学报,2019,41(10):1876-1884.

基金:国家自然科学基金(批准号:81573110);温州市重大科技专项(批准号:ZJ2017014)资助的课题