细胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)通常根据其产生机制分为3种亚型：外泌体、微囊泡和凋亡小体。三种细胞外囊泡粒径大小有较大差异，外泌体粒径一般为30～150 nm,微囊泡的粒径为100～1 000 nm,而凋亡小体的粒径为50～5 000 nm[1]。根据来源的不同，EV可能包含不同类型的功能蛋白、mRNA、miRNA和DNA片段，由磷脂双层包封形成，从亲本细胞释放，并通过体液转移到远处组织细胞。虽然部分蛋白质在几种EV中都存在表达，但事实上不同EV中的内容物具有非常强的异质性，并且与供体细胞的类型和状态息息相关。而EV内容物的多样性使得EV能参与众多重要细胞过程的调节[2]。大量研究[3]表明，由某些肿瘤细胞衍生的EV在肿瘤免疫过程中起着重要作用。除此以外，免疫细胞衍生的EV同样会在肿瘤免疫中发挥不可轻视的作用。然而，EV介导的肿瘤细胞和免疫细胞彼此间的互相作用尚未完全阐明。该文将聚焦EV在肿瘤细胞和免疫细胞间架起通讯桥梁中的作用，讨论各种来源的EV在肿瘤免疫、抗原呈递及免疫反应激活或抑制中的调节作用。

1、肿瘤衍生EV对免疫细胞的调控作用

肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中存在多种免疫细胞浸润，如淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)、树突状细胞(dendritic cell, DC)、单核细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞(MDSC)、粒细胞(中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)和肥大细胞[4]。这些细胞的主要作用是确保免疫监视。然而，肿瘤细胞能调节这些免疫细胞内的信号通路并将其功能转化为免疫抑制状态，从而有利于肿瘤细胞的存活与增殖。尽管肿瘤衍生EV含有能够引发抗肿瘤免疫反应的肿瘤抗原，但事实上肿瘤衍生EV内存在的大量免疫抑制效应的生物活性物质往往能抑制抗肿瘤免疫反应[5]。因此，EV是肿瘤细胞和免疫细胞彼此通信的重要部分。

1.1 T淋巴细胞

肿瘤衍生EV可通过递送生物活性物质导致T细胞功能障碍。MicroRNA(miRNA)是一种含有19～24个核苷酸的内源性非编码RNA,可通过与靶向mRNA的3′UTR或开放阅读框结合在细胞中发挥调节功能并导致与之配对的靶向mRNA沉默。肿瘤衍生EV可携带miRNA扩散到TME和身体其他部位，影响其中的免疫细胞。鼻咽癌NP69细胞衍生的EV携带大量的miR-24-3P,可通过靶向成纤维细胞生长因子11直接阻断T细胞功能[6]。而EV中除了携带有miRNA,还会存在一些可影响T细胞活性的蛋白质。14-3-3ζ是一种在肝细胞癌中过表达的蛋白质，可促进肝细胞癌中的细胞增殖和上皮间充质转化。携带14-3-3ζ的EV可将其递送至肿瘤浸润的T淋巴细胞并抑制其抗肿瘤功能[7]。另有研究[8]表明，乳腺癌来源的外泌体可将其携带的功能性细胞程序性死亡受体配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)转移到其他低表达或不表达PD-L1的肿瘤细胞中，继而重塑TME并抑制T细胞功能。黑色素瘤来源的EV上PD-L1的表达可被γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)上调，并同样可抑制CD8+T细胞的功能。

调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)是T细胞的一个特殊亚群，在免疫反应中起负调节作用，对维持人体免疫耐受性极为重要。Tregs可通过分泌转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和白细胞介素(interleukin, IL)-10等抑制因子抑制CD4+/CD8+T细胞活性，促进TME中的肿瘤生长。大量研究表明，肿瘤衍生EV可促进Treg的产生。如结直肠癌来源的EV能够通过激活TGF-β/信号转导与转录激活因子信号传导和灭活应激活化蛋白激酶信号传导来诱导T细胞分化为Treg细胞[9]。鼻咽癌来源的EV可促进CD4+T细胞分化为辅助性T细胞(T helper cells, Th)1和Th17细胞，同时还可促进Tregs增殖[10]。几种肿瘤衍生EV中均含有高水平miR-214,可下调T细胞中抑癌基因PTEN表达并促进Tregs在TME中的扩增，然后Tregs可以通过释放高水平的IL-10来诱导效应T细胞凋亡并促进肿瘤生长[11]。

1.2 B淋巴细胞

B细胞是一种产生抗体并介导体液免疫反应的淋巴细胞，也可作为抗原呈递细胞启动适应性免疫反应。调节性B细胞(regulatory B cells, Bregs)是B细胞的一个特殊亚群，在抗肿瘤免疫反应中起负作用[12]。肿瘤衍生EV可以直接抑制B细胞的免疫功能，也可以间接激活Bregs从而损害B细胞的功能。胰腺癌细胞来源的EV携带大量肿瘤抗原，可诱使B细胞产生自身抗体反应，从而限制补体介导的细胞毒性。源自食管癌的EV可诱导幼稚B细胞分化为Bregs, Bregs可通过分泌TGF-β抑制CD8+T细胞的增殖[13]。研究[14]表明支原体感染肿瘤细胞后可通过肿瘤衍生EV来传递自己的成分并调节免疫细胞活性，携带支原体成份的肿瘤衍生EV可特异性激活脾脏中的Breg细胞从而抑制效应T细胞的活性。

1.3巨噬细胞

巨噬细胞是先天免疫中的主要效应细胞，不仅可通过强吞噬作用清除抗原和异物，还可提呈抗原参与适应性免疫应答。在不同的组织环境中，巨噬细胞将分化为不同的功能状态，即脂多糖、IFN-γ诱导的经典激活M1型和IL-4诱导的替代激活M2型。M1型巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、IL-6等在抗肿瘤免疫中起到抗肿瘤作用，而M2型巨噬细胞可通过分泌TGF-β、IL-10等细胞因子起促肿瘤作用[15]。

大量研究[16]表明，肿瘤衍生EV可通过各种方式将巨噬细胞重编程为M2样表型以促进肿瘤进展。卵巢上皮细胞来源EV中的miR-222-3p可通过下调巨噬细胞中细胞因子信号传导抑制因子3的表达来促进巨噬细胞M2极化。而M2型巨噬细胞可通过促进血管和淋巴管生成来促进肿瘤生长。肺癌细胞衍生的EV也被发现可以改变巨噬细胞生物能量状态，提升M0型巨噬细胞的耗氧量将其诱导为偏向氧化磷酸化代谢模式的M2表型[17]。此外，肺癌衍生EV携带的miR-21和miR-29a可分别作用于人巨噬细胞Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)8或小鼠巨噬细胞TLR7,通过触发核转录因子核因子-κB介导的炎症进一步增强巨噬细胞中IL-6和TNF-α的分泌，进而有利于肺癌的转移及生长[18]。负载在乳腺癌外泌体上的膜联蛋白Ⅱ通过激活p38/丝裂原活化蛋白激酶、核转录因子核因子-κB和STAT3信号通路增加巨噬细胞对TNF-α和IL-6的分泌，从而为血管生成和肿瘤转移提供有利条件[19]。

1.4 DC细胞

DC细胞可识别、摄取、处理外来抗原，并通过提供抗原肽来诱导T细胞活化和增殖，是一种重要的抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)。此外，DC可以通过分泌多种细胞因子和趋化因子来调节其他免疫细胞的功能。研究[20]表明，肿瘤衍生EV可通过抑制TME中DC的抗原提呈功能来促进肿瘤生长和转移。如胰腺癌衍生EV中的miR-212-3p和miR-203可下调主要组织相容性复合物-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)转录因子调节因子X相关蛋白、TLR4和DC中下游细胞因子的表达，诱导其免疫耐受能力并促进胰腺癌的免疫逃逸。而肺癌和乳腺癌来源的EV甚至可以抑制骨髓前体细胞分化为CD11c+DC,从而实现免疫抑制微环境的转变[20]。此外，黑色素瘤和结直肠癌EV可诱导CD14单核细胞分化为髓源性抑制细胞，从而抑制抗肿瘤免疫反应[21]。

1.5 NK细胞

NK细胞是人体抗感染及抗肿瘤的第一道防线。在病理条件下，NK细胞可以杀死癌变和感染的细胞而不受MHC限制[22]。急性髓系白血病来源的EV通过携带NK细胞激活受体自然杀伤细胞2族成员D(natural killer group 2 member D,NKG2D)的配体并释放TGF-β可直接降低NKG2D表达，继而抑制NK细胞的活性和细胞毒性。跨膜糖蛋白MICA/B是NKG2D的配体，与其他MHC I类蛋白不同，它们与NK细胞的NKG2D结合而不与抗原肽结合。EV携带的跨膜糖蛋白MICA/B可通过抑制NKG2D的表达和促进肿瘤免疫逃逸来抑制NK细胞毒性[23]。此外，肿瘤衍生EV可通过递送TGF-β和miRNA来抑制NK细胞功能。多项研究[24]表明肿瘤衍生EV可通过递送TGF-β来抑制丝氨酸和苏氨酸激酶mTOR的激活，从而损害NK细胞活性和细胞毒性。肝癌来源EV携带的miR-92b可抑制NK细胞CD69的表达并抑制NK细胞介导的细胞毒性。

2、免疫细胞衍生EV对抗肿瘤免疫的影响

近乎所有细胞都具备产生并释放EV的能力，TME中的免疫细胞亦不例外。生理条件下免疫细胞即可释放EV,而某些环境因素(如低氧、pH和葡萄糖含量)及物理刺激，亦可促进免疫细胞EV的产生。事实上，免疫细胞EV作为TME中的重要信使深度参与了抗肿瘤免疫的构建与调节，并且正作为潜在的癌症治疗候选药物而备受关注[25]。

2.1 T细胞EV

T细胞与APC的相互接触并通信的过程中，T细胞在与APC接触的界面上释放大量EV。这些T细胞来源的EV单向转移到APC中可增强其功能。T细胞衍生EV表面存在CD3/TCR、CD2、MHCⅠ/Ⅱ类分子、趋化因子受体CXCR4,可能参与靶细胞的相互作用过程[26]。此外，T细胞衍生的EV含有细胞因子和RNA片段，可通过直接受体激活和调节基因表达来调节周围免疫细胞的能力。CD4+T细胞衍生EV被证明可以促进抗原特异性B细胞反应。活化CD4+T细胞衍生EV还可通过递送IFN-γ将巨噬细胞重编程为促炎表型来破坏免疫抑制型TME[27]。另有研究[28]表明抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)可通过其衍生EV影响CD8+旁观者T细胞的功能。在没有抗原刺激的情况下IL12刺激CTL产生的EV能诱导CD8+旁观者T细胞激活并产生IFN-γ和颗粒酶B。但在某些特定情况下，T细胞EV也可介导肿瘤免疫逃逸。如CD8+FasL+癌症小鼠模型中，T细胞EV可通过FasL诱导的基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)表达诱导B16黑色素瘤和肺癌的转移[29]。CD8+PD-1+Tim3+的耗竭T细胞EV可诱导CD8+PD-1-Tim3-T细胞耗竭，并抑制其分泌IFN-γ和IL-2的能力[30]。另外，一项自身免疫领域的研究[31]表明含有耗竭标志物及T细胞抑制相关miRNA的T细胞EV可驱动T细胞耗竭。

2.2 DC细胞EV

由于MHC分子、共刺激分子(CD40、CD80、CD86)、乳黏蛋白和细胞间黏附分子-1等黏附蛋白及C型凝集素受体在表面表达，DC衍生EV是介导T细胞激活的合适刺激因子[32]。DC衍生EV可迁移到肿瘤或脾脏，并通过MHC分子提呈抗原以刺激T细胞反应。DC衍生EV表面存在的抗原肽/MHC复合物可直接向T细胞提呈抗原。同时，DC衍生EV可被其他APC摄取，抗原肽/MHC复合物可通过APC内体途径再加工并再度提呈给T细胞。此外，DC衍生EV还可被肿瘤细胞吞噬，并将肿瘤细胞转化为效应免疫细胞的更强免疫靶点[33]。DC还可分泌不同大小并具有不同功能的EV。未成熟DC分泌的大EV可诱导包括IL-13、IL-5、IL-4在内的Th2细胞因子分泌，小EV可诱导IFN-γ等Th1细胞因子分泌。而成熟DC细胞产生的EV均诱导Th1细胞因子分泌。DC衍生的EV可促进IL-15Rα和NKG2D依赖的NK细胞增殖和活化，从而产生由NK细胞介导的抗转移作用[34]。

2.3 NK细胞EV

NK衍生EV表面存在包括NKp46、NKp30、NKp44、NKG2D和DNAM-1在内的典型NK表面受体。因此，NK衍生EV的释放能够诱导肿瘤细胞凋亡。除此以外，NK细胞释放的EV可递送大量细胞毒性蛋白，包括穿孔素、颗粒酶、颗粒溶血素、FasL/CD178、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL/CD253)和小抗菌肽[35]。 这些效应分子可通过直接杀伤途径机制破坏包括乳腺癌、黑色素瘤和血液系统恶性肿瘤在内的靶细胞[36]。NK衍生EV还包含其他参与细胞归巢、黏附和免疫激活的分子，可导致间接肿瘤杀伤。例如，NK衍生EV可通过刺激外周血单核细胞和增加CD56+NK细胞的比例发挥作用。携带miRNA-186的NK衍生EV可靶向抑制癌基因(包括MYCN、AURKA、TGFBR1和TGFBR2)的表达，并抑制高危神经母细胞瘤患者的TGFβ1依赖性免疫逃逸[37]。NK衍生EV还可将NK细胞高度表达的miR-223递送到肝形状细胞来抑制TGFβ诱导的肝纤维化，从而通过ATG7靶向抑制自噬[38]。

2.4巨噬细胞EV

巨噬细胞衍生EV的功能取决于亲本细胞的表型。M1巨噬细胞衍生EV携带有miRNA-16-5p,可通过降低PD-L1的表达来增强T细胞依赖性免疫应答从而抑制胃癌的进展。而M2巨噬细胞衍生的EV中存在高水平的miRNA-12-5p和miRNA-155-5p,可降低结直肠癌细胞中BRG1的表达从而促进癌细胞的迁移和侵袭[39]。巨噬细胞EV中的长链非编码RNA也可调节TME并参与肿瘤发病机制。M2巨噬细胞衍生EV携带有长链非编码RNA AFAP1-AS1,可通过结合miRNA-26a上调ATF2,促进食管癌的侵袭和转移。除了携带有核酸，巨噬细胞EV中还封装有多种蛋白质效应分子，如ERAP1、CCL3、TNF-α、IFN-γ等。而M1巨噬细胞衍生EV可将M2巨噬细胞复极化为M1表型，并增强抗PD-L1抗肿瘤治疗的疗效[40]。

3、结论与展望

免疫治疗已逐渐应用于各种恶性肿瘤治疗方案之中，以免疫检查点阻断剂为代表的部分药物已显示出显著的临床疗效。但在相当一部分恶性肿瘤中，免疫治疗并未取得理想的治疗效果[41]。造成这一现象的一个重要原因即是肿瘤对免疫微环境的持续改造并不断影响其中各种免疫细胞的表型及功能[42]。而肿瘤免疫微环境中各种细胞产生的各种EV则在这一复杂过程中扮演着信使的角色，在许多方面影响着肿瘤免疫串扰的结果。深入了解肿瘤EV和不同免疫细胞EV的功能对于理解肿瘤免疫进程至关重要。此外，由于分离EV后可鉴定其亲本细胞的独特标志物，EV可作为包括癌症在内的多种疾病的特异性生物标志物。并且多项研究正致力于改造肿瘤及免疫细胞衍生EV,将其作为递送药物的载体进行抗肿瘤治疗[43]。肿瘤来源的EV可装载化疗药物，用于恶性胸水及肝外胆管癌的治疗[44-45]。荷载二甲双胍的巨噬细胞衍生EV可促进抗PD-1治疗[46]。因此，肿瘤免疫微环境中的各种EV既可以成为潜在的诊断及预后预测标志物，也可以成为肿瘤免疫治疗的靶点与载体。关于TME中EV的研究正在迅猛发展中，持续的突破将更好地揭示肿瘤及免疫细胞衍生EV在肿瘤免疫过程中的复杂功能，并有望使EV成为更有前景的新型肿瘤治疗方法。

基金资助:国家自然科学基金(编号：82322049、82150103、82071864、82270830)； 科学技术部高技术研究发展中心国家重点研发计划(编号：2022YFA1206000)； 湖北省“青年拔尖人才培养计划”(编号：鄂组通[2021]17号)；

文章来源:黎劼潇,陆枢桠,张佳宁,等.肿瘤微环境中细胞外囊泡释放对肿瘤免疫的影响[J].安徽医科大学学报,2024,59(08):1302-1306.