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重组腺相关病毒装载目的核酸完整性分析

2024-06-20 26 上传者：管理员

摘要：目的探讨重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)装载目的核酸完整性检测方法，并初步建立分析算法。方法消化rAAV外游离DNA片段，提取病毒基因组，设计5对搭接引物，采用正交排列方式，分别用数字PCR仪进行检测，常规条件采用EveGreen和模板4μL的20μL反应体系，数字PCR条件：95℃5 min;95℃15 s,55℃30 s,72℃90 s,45个循环。超长核酸片段增强条件采用Mix B-2 000 bp和模板2μL的25μL反应体系，采用仪器附带软件定量。最小二乘法拟合分析共有的全长片段数量，进而解读目的核酸完整性分布情况。结果引物间距离不大于1 200 nt的片段可得到有效扩增，经系统分析得到一系列片段长约1 000 nt的有效片段拷贝数，最小二乘法拟合分析共有片段拷贝数量，估计样本中全长片段不多于1 234 copies/μL，该值与测得的最大值(1 443 copies/μL)之间差异有统计学意义(P <0.05)，差异占比约16.9%。结论初步建立了rAAV装载目的核酸完整性的检测方法，并分析出供试品中存在一定数量的不完整目的核酸，为后续深入研究奠定了基础。

关键词：
rAAV
完整性
数字PCR
核酸
重组腺相关病毒
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以重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,r AAV）为载体进行基因治疗已成为热点。全球有多款制品获批上市，如2012年欧洲药品管理局（European Medicines Agency,EMA）批准上市的Glybera,2017年美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA)(2018年EMA）批准上市的Luxturna,2019年FDA批准上市的Zolgensma,2022年EMA批准上市的Upstaza,2022年EMA批准上市的Roctavian等[1,2,3,4,5]。

目前，r AAV载体制品的主流生产工艺为以三质粒包装系统[6,7]，因其较好的安全性被普遍采用，但该系统同时会产生相当数量的空病毒颗粒（不含核酸）、目的核酸不完整病毒颗粒和非目的核酸病毒颗粒等[8]。这些颗粒提高了制品的免疫原性和安全性风险，同时还降低了制品的有效性，在《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》中作为杂质被提及[9]。本文探讨了一种评估制品目的核酸完整性和中长片段相对于完整核酸的占比方法。

评估r AAV包装核酸有如下方法：提取核酸染色后进行毛细管电泳（capillary electrophoresis)[10,11,12]，该方法可很好地区分核酸的大小，但缺少对目的基因核酸的识别；提取核酸后进行数字PCR(digital PCR）多种荧光检测[13,14,15]，通过对共荧光微滴或微孔数量和荧光强度的检测，用泊松分布定量长片段的核酸数量，需验证多对引物效率的一致性；第三代测序技术[16,17,18]，核酸经前处理后，进行单分子测序（single molecule real time sequencing），目前测序策略受限于核酸合成延长方向，测得制品信息不完整。本研究采用第2种方法的衍生版本，提取核酸后进行数字PCR分段搭接定量，采用同种核酸染料，相同的初始浓度模板，对各引物对分别进行核酸拷贝数定量，进而判断完整核酸拷贝数和中长片段不完整核酸的大致分布。

1、材料与方法

1.1 供试品

r AAV样品由中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室提供。

1.2 主要试剂及仪器

Eve Green、Sapphire Chip及NaicaTMCrystal Digital PCR System（型号：Naica）为法国Stilla Technologies公司产品，软件系统为数字PCR仪附带分析系统；DNaseⅠ和DNaseⅠreactionbuffer购自美国NEB公司；病毒基因组DNA提取试剂盒购自瑞士ROCHE公司。

1.3 病毒基因组提取

取r AAV供试品，用DNaseⅠ消化游离DNA，再用病毒基因组DNA提取试剂盒提取病毒基因组，按试剂盒说明操作。

1.4 数字PCR检测

1.4.1 引物设计及组合

从r AAV基因组一侧[不包括反向末端重复（inverted terminal repeat,ITR）序列区]向另一侧分别设置5条正向引物（F1、F2、F3、F4和F5）和5条反向引物（R1、R2、R3、R4和R5），排列顺序为F1、F2、R1、F3、R2、F4、R3、F5、R4和R5，引物序列见表1，引物组合见图1，引物间组合的理论扩增长度见表2。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

表2 引物组合理论扩增长度（nt)

图1 引物位置示意图

1.4.2 数字PCR反应

按数字PCR仪操作说明进行15次检测，反应体系：2×Eve Green和5×mix共10μL,100μmol/L正反向引物各0.5μL，经100倍稀释的DNA模板4μL，水5μL，共20μL。反应条件：95℃5 min;95℃15 s,55℃30 s,72℃90 s,45个循环。

超长核酸片段（本文中泛指引物对之间扩增片段超过1 250 nt或泊松曲线拟合不确定度大于5%的核酸片段）按Sapphire Chip的长片段优化方法增强检测，采用Mix B-2 000 bp，反应体系25μL，加入1 000倍稀释的DNA模板2μL，其他同上，不足体积用水补齐。

1.4.3 检测结果处理

r AAV基因组被10条引物分割成11个区域，不计两端ITR区，共有9个区域，分别定义为m1～m9，其中m1代表F1和F2之间的片段及其表观拷贝数；m2代表F2和R1之间的片段及其表观拷贝数；m3代表R1和F3之间的片段及其表观拷贝数；m4代表F3和R2之间的片段及其表观拷贝数；m5代表R2和F4之间的片段及其表观拷贝数；m6代表F4和R3之间的片段及其表观拷贝数；m7代表R3和F5之间的片段及其表观拷贝数；m8代表F5和R4之间的片段及其表观拷贝数；m9代表R4和R5之间的片段及其表观拷贝数。如F4和R5之间包括m7、m8和m9。

预期值（或拟合值）m1～m9与实际检测值（可用值，泊松曲线拟合不确定度不大于5%）的关系为：（F1/R1-m1)2+(F1/R1-m2)2+(F2/R2-m2)2+(F2/R2-m3)2+(F2/R2-m4)2+(F3/R3-m4)2+(F3/R3-m5)2+(F3/R3-m6)2+(F4/R4-m6)2+(F4/R4-m7)2+(F4/R4-m8)2+(F5/R5-m8)2+(F5/R5-m9)2+(F4/R5-m6)2+(F4/R5-m7)2+(F4/R5-m8)2+(F4/R5-m9)2，采用最小二乘法拟合，并通过拟合使前式的结果最小。如F1/R1代表引物对条件下实测值。

1.5 统计学分析

检测值的误差（SD）由泊松曲线拟合的不确定度提供，视为20 000数据点下的曲线标准差。拟合值的误差由参与拟合的检测值的误差提供，误差平方和平均后再开方。检测值或拟合值的95%参考范围为M±1.96×SD,M为检测值或拟合值，t(α=0.05,20 000，双侧）=1.96。

2、结果

2.1 数字PCR检测结果

15次常规检测结果及对不确定度>5%的试验采用增强方法再次检测的结果见表3。从总体上看，泊松曲线拟合不确定度不超过5%，数据基本可用，超过5%的数据较为混乱，且此时对应的Ct值超过20，片段长度超过1 236 nt，超长核酸片段PCR扩增反应所得数据变异度较大。

2.2拟合结果

调节m1～m9的值使其距离实测数据差平方和最小，精度至个位，得到各m(copies/μL):m1=1 298,m2=1 323,m3=1 348,m4=1 291,m5=1 234,m6=1 362,m7=1 427,m8=1 349,m9=1 301，见图1。最小值为1 234，理论上讲，m值是包含这段所有实测结果的平均值。

依据表3中的泊松曲线不确定度评估各实测值是否与最小值（1 234）存在差异显著性，显著性α=0.05，自由度约为20 000,t值取1.96，如F4/R4,95%参考区间下限值1 358[1 443×（1-1.96×0.03)];m5的95%参考区间上限值1 331[1 234×（1+1.96×0.04）]，前者大于后者，提示F4/R4检测值与m5(F3/R3）值之间存在显著性差异（P<0.05），即1 443与1 234之间的差异有统计学意义，如全长的核酸不高于1 234，则1 443包含更多局部断裂的片段，如此估计，较1 234多出的片段比例为16.9%(1 443/1 234-1）。

其他实测值同上分析（扩展不确定度估计），差异均不显著（P>0.05）。

2.3 中长核酸片段分布

m1～m9的值总体呈现“马鞍”状，见图2，在距离两端ITR区2 000 nt范围内分别呈现1个峰，尾端的峰值与最小值之间差异有统计学意义（P<0.05）；首端的峰值与最小值之间差异无统计学意义（P>0.05);2个峰值之间差异无统计学意义（P>0.05）。

图2 核酸中长片段分布图

表3 q PCR检测结果

3、讨论

对r AAV中装载不完整目的核酸中长片段的分布检测存在困难。首先，从完整目的核酸角度，相对较易定量，如采用数字PCR共荧光策略，但从不完整的核酸角度分析较困难，因为从目前的分析结果看（这里只讨论r AAV基因组长度小于衣壳装载空间，约小于5 000 nt的情况），不完整目的核酸的丰度伴随着位置变化，大体趋势为分子摩尔数从一侧ITR区向另一侧ITR区递减/递增，同时另一侧ITR区也有类似递减/递增情况，趋势函数未知；其次，PCR反应的检测长度非常有限，从实验结果看，极限长度约在1 200 nt（虽然经过优化可扩增更长片段，但检测体系定量稳定性受到影响，定量误差较大）；最后，该方法需反复用数字PCR定量，成本较高。

采用数字PCR分段搭接定量策略是以数字PCR泊松分布定量原理为基础设计形成，即分散在微滴/微孔中的模板数量需稀释至一个较为合适的范围，多数微滴/微孔只有1个模板存在，少量含有2个模板，再少量含有3个以上模板，与微滴/微孔数量间[目前设备以P(0）计算为主]的关系符合泊松分布，进而通过拟合得到初始模板的数量[19,20]。使用同种荧光染料，通过多次检测方式，只是1对引物由模板数量带来的荧光梯度，可弱化不同引物对之间的效率差带来的影响，对结果估计的影响相对较小[21,22]。当然太弱的合成反应导致扩增系统不稳定，结果变异度较大，这也非常考验仪器的检测灵敏度[23,24,25]，如文中结果展示低于仪器灵敏的数据，拟合的误差非常大，且结果也不准确。从目前的结果来看，有效结果可能包括以下几个特征：扩增长度不超过1 250 nt,Ct值不超过20，曲线拟合的不确定度≤5%。

引物的设计原理是以扩增片段可相互搭接为主要要求（图1），并通过共有数量判断可能的全长拷贝数（只是不超过），进而通过误差范围判断哪些片段数量超出检测误差范围，超出全长拷贝数误差范围的部分极大可能是不完整目的核酸序列。为简化实际工作的检测和分析困难，本研究未考虑两端的ITR区，ITR区多为双链，对定量检测有一定干扰，将在后续工作中逐步开展相关研究。

拟合的原理是将全长目的基因按引物划分为9段，拟合后的这9段的含量拷贝数只是表观共有的含量拷贝数量，如m2的拷贝数只是表示F1/R1与F2/R2之间搭接区段的表观含量拷贝数量，而非搭接区段的实际拷贝数量（由于有扩增引物区间内的片段存在，只能定义为表观拷贝数量）。由于需选择共有部分，选择最小含量拷贝数作为共有部分。误差由泊松曲线拟合的不确定度提供，其视为20 000数据点下的曲线标准差，在95%参考范围是否彼此重合判断差异显著性。

本研究病毒核酸提取会有损失，提取过程也可能造成DNA链断裂，这些将在后续研究中不断改善。从目前的结果来看，包含F4/R4段不低于1 000 nt目的核酸不完整片段数量即占相当比例，提示在基因组定量等实验的引物选择或检测方式上应给予足够重视。

r AAV装载的目的核酸完整性分析类似于重组蛋白制品检测项目中的相关蛋白。截短的目的核酸是否还具有功能，目的核酸截短至什么程度仍有功能或失去功能，在无定论前，均只能视为杂质，但这种杂质很明显影响其他检测，且如何表征不完整性也较困难。

综上所述，本研究采用数字PCR分段搭接定量策略初步探讨了800～1 000 nt长度片段的大致位置和拷贝数量占比，为后续研究提供了可借鉴的思路。

参考文献:

[1]欧洲药监局最终同意批准首个基因治疗药物Glybera[J].药物评价研究,2012,35(5):336.

[2]首个基因治疗药物Glybera获欧委会批准上市[J].齐鲁药事,2012,31(12):697.

[3]治疗儿童脊髓性肌萎缩症[J].广东药科大学学报,2019,35(3):332.

[4]夏训明.美国FDA批准一种基因疗法药物治疗RPE65双等位基因突变型遗传性视网膜变性病[J].广东药科大学学报,2017,33(6):752.

[9]国家药监局药审中心.体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则(试行)[S].(2022-05-31)[2023-12-01].

基金资助:国家重点研发计划(2023YFC3403305); 中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(2023-PT350-01);

文章来源:黄天治,秦玺,于雷,等.重组腺相关病毒装载目的核酸完整性分析[J].中国生物制品学杂志,2024,37(06):641-645.