多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种由在骨髓中积聚并产生M蛋白的单克隆浆细胞造成的常见血液系统恶性肿瘤。MM患者常并发高钙血症、肾功能不全、贫血和骨质破坏，严重影响患者的生命健康和生活质量[1]。目前蛋白酶抑制剂、免疫抑制药物、单克隆抗体和造血干细胞移植等众多方案已被用于MM的临床治疗[2],但对于大部分患者来说，耐药、复发等情况不可避免，亟待研发新型的安全有效的治疗方法。

B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)又名TNFRSF17、CD269,在所有MM细胞中均有表达，而在正常细胞上的表达仅限于浆细胞和小部分B细胞[3]。常规的CAR-T细胞指的是αβT细胞，其发挥发挥细胞毒作用依赖主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)限制性，目前，靶向BCMA的CAR-αβT细胞治疗MM的客观缓解率高达73%～97%[4]。然而，细胞因子释放综合症、中枢神经毒性等是BCMA CAR-T细胞治疗的常见不良反应[5,6,7]。此外，目前以αβT细胞作为受体细胞的CAR-T疗法为个体化治疗，其高昂的制备费用、较长的制备时间、患者T细胞质量等，均制约着BCMA CAR-T细胞的进一步应用。

γδT细胞是一类固有免疫细胞，与目前常用作CAR-T细胞的αβT细胞不同，天然γδT细胞以MHC非限制性的方式直接识别多种肿瘤细胞，发挥细胞毒作用，而且不会引起细胞因子风暴、移植物抗宿主病等不良反应，安全有效[8],是同种异体“现货型”CAR-T细胞的理想受体细胞，正好弥补了传统BCMA CAR-αβT细胞的不足。因此，本研究旨在构建靶向BCMA的CAR-γδT细胞，并在体外初步评价其抗MM的疗效。

1、材料与方法

1.1 细胞与试剂

1.1.1 细胞：

人慢性髓系白血病细胞系K562、K562过表达人BCMA细胞株K562-BCMA、人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji、人骨髓瘤细胞系MM1.S、人骨髓瘤细胞系H929,人肾上皮细胞系HEK 293T,5位健康供者来源人外周血淋巴细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。本项目经中国医学科学院基础医学研究所伦理审查委员会批准(项目批号：2021017),所有供者均签署知情同意书。

1.1.2 试剂：

RPMI-1640、DMEM、硫酸鱼精蛋白(Sigma-Aldrich公司);胎牛血清FBS(Gibco公司);IL-2(北京四环制药有限公司);人外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品有限公司);T cell Transact(Miltenyi公司);anti-TCR pan γδ(Beckman Coulter公司);anti-CD3ζ、β-actin一抗和山羊抗兔IgG-HPR(Abcam公司);jetPRIME(Polyplus公司);APC anti-human TCR α/β、APC anti-human TCR γ/δ、APC anti-human CD269、APC isotype Ctrl Antibody(Biolend公司);非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司);annexin V red dye(Sartorius公司)。

1.1.3 仪器：

多功能细胞观测显微镜Evos FL Auto 2;流式细胞仪Accuri C6 plus; 活细胞长时程分析系统Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument。

1.2 方法

1.2.1 质粒瞬时转染分为3组：

未处理组(blank)、空载体组(vector)、表达质粒组(BCMA-CAR)。24孔板铺入293T细胞3×105 cells/well, 于37 ℃, 5% CO2孵箱中培养8 h, 分别将2 μg空载体质粒或慢病毒表达质粒与4 μL jet PRIME混匀在200 μL Buffer中，静置10 min, 移入对应组别中，于孵箱中培养24 h。EVOS观察GFP表达。

1.2.2 Western blot检测蛋白质表达：

RIPA裂解瞬时转染的293T细胞，BCA测定蛋白浓度。配制10%分离胶与5%浓缩胶，垂直电泳分离蛋白，电转220 mA定时150 min, 5%脱脂奶粉室温封闭3 h, 孵育一抗anti-CD3ζ(稀释比1∶1 000)4 ℃过夜，随后孵育二抗山羊抗兔IgG(稀释比1∶1 000),室温孵育2 h。得到anti-CD3ζ显影结果后，洗脱孵育一抗β-actin及其对应二抗，得到β-actin显影结果。

1.2.3 慢病毒包装与浓缩：

于T75培养瓶中铺入2×106个293T细胞，孵箱培养20 h后换液。将10 μg总质粒(慢病毒表达质粒：包装质粒psPAX2:包膜质粒pMD2.G=4∶3∶1)与20 μL jetPRIME混匀在500 μL Buffer中，静置10 min后加入293T细胞中，继续培养48 h。收集上清，经滤器过滤后，于100 kDa离心式超滤管中，设置离心5 000×g,4 ℃,30 min, 收集截留浓缩液分装储存至-80 ℃。

1.2.4 慢病毒滴度测定：

12孔板铺入293T细胞5×105 cells/well, 孵箱培养8 h, 分别加入1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL慢病毒浓缩液与5 μg/mL硫酸鱼精蛋白，孵箱培养24 h后换液，继续在孵箱培养48 h。于EVOS荧光显微镜下观察荧光蛋白表达情况，并取细胞清洗后使用Accuri C6 Plus上机检测感染效率，以感染效率接近90%的293T细胞组别为基准，293T细胞感染阳性数量除以最小慢病毒体积即为慢病毒的生物学活性滴度。

1.2.5 CAR-T细胞制备：

取健康人外周血后，分离得到人外周血淋巴细胞。1×106 PBMCs/well与10 μL/well T cell Transact混合移入48孔板中得到αβT细胞活化组；3×106 PBMCs/well移入TCR pan γ/δ抗体包被过的24孔板中，得到γδT细胞活化组。日常培养200 U/mL IL-2+RPMI-1640(含丙酮酸钠，HEPES,L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇)+15% FBS。αβT细胞与γδT细胞活化至少24 h后，以MOI=5分别加入空载体与BCMA-CAR慢病毒浓缩液与硫酸鱼精蛋白，设置离心1 000×g,30 ℃,1 h, 离心完成后于孵箱培养8 h。将细胞清洗后移入原孔，继续培养至第8天。Accuri C6 Plus上机检测αβT细胞纯度在95%以上，γδT细胞纯度在80%以上可用作后续实验，最后得到Vector-αβT、BCMA CAR-αβT、Vector-γδT、BCMA CAR-γδT四种效应细胞组别。

1.2.6 流式检测肿瘤细胞表面蛋白：

设置空白对照组，同型对照组与BCMA检测组。每组加入2×105个状态良好的肿瘤细胞，1×PBS(pH=7.4)洗两遍，1% BSA封闭液4 ℃封闭10 min。同型对照组和BCMA检测组分别加入APC isotype Ctrl Antibody和APC anti-human CD269,4 ℃孵育30 min。1×PBS(pH=7.4)洗3遍，150 μL 1×PBS(pH=7.4)重悬，Accuri C6 Plus上机检测肿瘤细胞BCMA表达情况。

1.2.7 LDH释放法检测CAR-T细胞毒活性：

选择培养至第9～10天的CAR-T细胞，按效靶比5∶1铺入U型96孔板得到实验孔，5% CO2孵箱中培养6 h。离心后取上清50 μL/well, 移入平底96孔板，加入检测底物混合物50 μL/well, 混匀后室温避光孵育30 min。加入50 μL/well反应终止液，充分振荡混匀，使用分光光度计在492 nm处测得吸光度值。细胞毒活性计算公式如下：

细胞毒活性(%)=(实验校准孔-效应细胞LDH自发释放校准孔-靶细胞LDH自发释放校准孔)/(靶细胞LDH最大释放校准孔-靶细胞LDH自发校准孔)×100%

1.2.8 活细胞长时程细胞分析：

取肿瘤细胞5×103 cells/well种入多聚赖氨酸包被后的平底96孔板，于孵箱培养24 h。弃去上清，加入含有annexin V red dye的完全培养基，按效靶比2∶1加入效应细胞。在1 h内上机，设置检测程序10×红色荧光镜头，4 field/well, 24 scan/day。

1.3 统计学分析

数据表示为均数±标准差使用GraphPad Prism 8.0.1软件对实验数据进行统计分析，组间总体差异分析采用独立样本t检验，活细胞长时程细胞分析法组间比较采用双因素方差分析(Two-way ANOVA),当P<0.05,认为其差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 BCMA-CAR分子重组慢病毒载体的制备及表达验证

参考BCMA嵌合抗体序列[9],优化并合成人源化单链抗体序列(single-chain fragment variable, scFv)。通过同源重组，插入包含第三代CAR分子结构及C端用P2A连接ZsGreen荧光的慢病毒表达载体上，其结构如图1所示。对照载体(vector)为只包含ZsGreen荧光的慢病毒载体。

BCMA-CAR慢病毒表达载体瞬时转染293T细胞，24 h后荧光显微镜下观察到ZsGreen荧光信号(图2A)。收集细胞，使用Western blot检测细胞表达CD3ζ融合蛋白情况，结果显示在70 ku marker条带下方可见特异性BCMA-CAR分子条带(图2B)。上述结果说明BCMA-CAR分子能在细胞内表达。

2.2 BCMA-CAR慢病毒载体的包装与滴度检测

用3质粒包装系统，将BCMA-CAR慢病毒表达载体、包装质粒PAX2与包膜质粒PMD.2G共转染至293T细胞包装慢病毒，48 h在荧光显微镜下可观测到荧光信号。培养上清经过浓缩纯化后，分别以1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL慢病毒浓缩液感染293T细胞，72 h后利用流式细胞术检测病毒滴度(图3)。结果显示，2 μL慢病毒浓缩液组别的293T细胞绿色荧光阳性占比为89%,依此计算得到慢病毒滴度为2.23×108 Tu/mL。

2.3 BCMA CAR-γδT细胞制备

按MOI=5的慢病毒剂量感染在抗γ/δ TCR抗体活化24 h时的人PBMC,并于感染后7 d流式检测γδT细胞纯度和荧光表达情况。结果显示，γδT细胞纯度为83.35±5.12%(n=4),BCMA CAR-γδT细胞比例为48.15±9.86%(n=4)。同时按MOI=5感染CD3/CD28磁珠活化24 h的PBMC,7 d后流式检测αβT细胞纯度为99.06±0.22%(n=5),BCMA CAR-αβT细胞比例为59.18%±2.56%(n=5)。图3为一次代表性的结果。

图1 BCMA-CAR分子结构   

图2 BCMA-CAR表达验证  

2.4 BCMA CAR-γδT细胞的体外细胞毒活性检测

用流式细胞术分别检测人肿瘤细胞系K562、K562-BCMA(过表达人BCMA)、Raji、MM1.S和H929的BCMA表达水平。结果显示，K562-BCMA、MM1.S与H929表达高水平BCMA,而K562与Raji几乎不表达BCMA(图5)。

BCMA CAR-γδT细胞与上述肿瘤细胞系共孵育6 h后，检测上清LDH释放情况。结果显示，与空载体γδT细胞相比，BCMA CAR-γδT细胞对BCMA高表达的人骨髓瘤细胞系MM1.S、H929和过表达BCMA的K562细胞的细胞毒活性显著增强(P<0.001),而对BCMA表达阴性的K562和Raji细胞系无差异(图6A)。

用annexin V藕连红色荧光蛋白(red fluorescent protein, RFP),实时监测效应细胞诱发的靶细胞凋亡情况。结果如图5B所示，γδT细胞组别与αβT细胞相比，对K562、Raji、H929均展示出较强的非特异性杀伤，BCMA CAR-γδT细胞在体外对BCMA阳性的H929的细胞毒活性显著高于空载体对照γδT细胞，同时BCMA CAR-αβT细胞亦高于空载体对照αβT细胞，其结果具有统计学差异(P<0.001)。而对BCMA表达阴性的Raji细胞，BCMA CAR-γδT细胞几乎无细胞毒活性，但是空载体对照和BCMA CAR-γδT细胞也显示出非BCMA特异性的细胞毒活性。

上述结果说明，对BCMA阳性的靶细胞，BCMA CAR-γδT细胞能通过非特异性杀伤和BCMA靶向特异性的杀伤，在体外显示出较强的细胞毒活性。

3、讨论

靶向BCMA的CAR-αβT细胞在MM治疗中已取得了很好的疗效，目前已经有两个产品获批上市。但因其属于个体化治疗，往往需要较长制备时间和高昂的成本，并且临床应用中也存在难以避免的诸多不良反应，这使得靶向BCMA的同种异体“现货”的新型细胞的研发变得至关重要。

γδT细胞在肿瘤的细胞过继免疫治疗领域中有其独特的优势。γδT细胞能以MHC非限制性的方式直接广泛识别肿瘤相关抗原，分泌抗肿瘤功能的高水平细胞因子，对多种肿瘤细胞均可产生非特异性、快速、强大的杀伤作用[10];在临床应用中γδT细胞没有自体限制，可由健康的捐献者作为细胞来源，可开发同种异体的通用型细胞产品；而且多项临床试验显示天然和基因工程的同种异体γδT细胞在体内活化增殖受限，不会产生细胞因子风暴、移植物抗宿主病等风险，安全性良好[11,12]。因此，γδT细胞疗法便成为解决目前BCMA CAR-T细胞疗法面临的问题的重要方向之一。

图3 BCMA-CAR慢病毒滴度测定   

图4 γδT细胞与αβT细胞CAR分子表达流式散点图   

图5 流式细胞术检测肿瘤细胞表面BCMA的表达   

图6 CAR-γδT细胞毒活性检测   

本研究尝试用慢病毒载体，将靶向BCMA的第3代CAR分子转染到天然γδT细胞中，制备 BCMA CAR-γδT细胞， 并在体外初步评价其抗多发性骨髓瘤的疗效。实验结果显示，对BCMA表达阳性的靶细胞，BCMA CAR-γδT细胞能通过非特异性杀伤和BCMA靶向特异性的杀伤，BCMA CAR-γδT细胞与BCMA CAR-αβT细胞在体外均显示出优于其空载体T细胞的细胞毒活性；对于BCMA表达阴性的靶细胞，BCMA CAR-γδT细胞与BCMA CAR-αβT细胞相较于各自的空载体T细胞均无显著细胞毒活性的增强。据此，本研究成功构建了靶向BCMA的CAR-γδT细胞，为在动物体内进行下一步疗效和安全性验证奠定基础。

综上所述，本研究构建的新型BCMA CAR-γδT细胞在体外显示出显著增强的对BCMA阳性血液肿瘤细胞的细胞毒活性，有望进一步开展动物实验与临床实验，造福更多患者。

基金资助:中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-035);国家自然科学基金(32270915,U20A20374);

文章来源:李盈辉,许依,张建民,等.靶向BCMA的CAR-γδT细胞抗多发性骨髓瘤的疗效[J].基础医学与临床,2024,44(06):763-771.